威尼德分子杂交仪：Western试验问题归纳与总结

 Q1: PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

A1:一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，若反复洗几次后，蛋白容易掉下来，效果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，效果较好。

    Q2:做组织样品的western blot的时候，处理样品有什么诀窍？

A2: 必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂），封闭剂一般5%脱脂奶粉。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择

    Q3:免疫组化和Western blot可以用同一种抗体吗？

A3: 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western blotting，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）

    Q4: 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？

A4: 可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。

    Q5:Western blot哪种染色好？

A5: (1）阴离子染料是常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到 1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏，不能用于带正电荷的膜。灵敏度低。

(2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比较稳定。

（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

    Q6: 用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品是否需浓缩、纯化？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？

A6：按照提供的浓度，如果做Western blot，是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：

    1、转移时的时间，

    2、转移时的电流或电压.

    3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

    4、可以用13-15%的分离胶.

    Q7: 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小有一定关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？

A7：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。

    Q8: 采用生物素标记的二抗-SABC-DAB检测系统做western，非特异性的条带和背景很高，总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起，这是什么原因，如何解决？SDS—PAGE的时候恒压和恒流哪个好？

A8：非特异性的条带和背景高：可能性很多，如一抗，二抗，封闭的原因都可能。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起，这种现象是正常的。另外，也可能积层胶有问题。SDS—PAGE的时候，恒压和恒流都可以用。

    Q9: 血清样品进行Western blot 分析，目的蛋白21kD，结果显色出来后，目的条带很淡，而白蛋白和IgG条带很浓，为什么？

A9：可能是因为白蛋白为67kD和目的蛋白相差较大，且其浓度较低，可以底物二氨基联苯胺和0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟，再用去离子水漂洗以终止反应；也可能是抗体的特异性不好。把封闭的时间延长，同时提高封闭液的浓度，可以减少以下背景噪音。同时洗的时候要*，而目的条带弱，说明浓度不足，如果不考虑后续功能的话，可过G-50（细）柱子，纯化靶蛋白，接着真空冷冻浓缩，可以得到很好的结果。

    Q10: Western转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带，其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经5%的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进行一抗孵育（1：200，建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时（1:2000），均在室温下，DAB显色，虽出现蛋白条带，但较弱，且出现非特异性条带。所用Marker可分离14-116KD的蛋白，是否因为marker有问题？一抗（多克隆抗体）、二抗的浓度及孵育的时间是否合适？封闭的时间是否太短？

A10：1. marker有可能被降解，也有可能是上样量太少。

     2. 建议一抗4℃孵育过夜，稀释比为1:100；如室温孵育，两小时即可。

     3. 二抗室温1小时，1:2000，或 4℃封闭过夜（室温两小时就够），一抗室温1小时，二抗室温1小时，最好是一抗4℃过夜（或室温2小时）1:200，二抗室温1小时1:2000，换ECL法。