威尼德分子杂交仪：基因克隆知识问答及FAQ

基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称DNA克隆、分子克隆、基因重组或重组DNA技术。

      基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。为了方便大家学习和交流，我以问答形式介绍基因克隆及其常见问题，希望对大家有所帮助。

    Q1：如何获取一个已知基因的序列？

A1：对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道的基因序列直接作为自己DNA克隆的依据。目前，世界上主要的基因库有：

(1)EMBL，为设在欧洲分子生物学实验室的基因库；

(2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库

(3)Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白质序列库，其所含序列的准确度比较高，而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。

目前，以Genbank的应用最频繁。

    Q2：什么基因克隆法（Shotgun Cloning）？

A2：该方法是随机切割供体基因组DNA ，再转化到受体基因组中，根据对转化子的表型鉴定，然后找出所需克隆的基因，基因克隆战略成功地应用于分离细菌的无毒基因。Staskawica B. J .等利用这一策略，从大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的无毒基因。但是在高等植物中，由于基因组很大，因而应用这种方法进行基因克隆非常困难。例如，如果将此方法应用于番茄的抗病基因筛选，需要以双元载体构建抗病品种的基因文库，然后通过农杆菌等将它们导入感病品种之中，然后筛选抗病转化体来分离抗病基因。但这样鉴定一个单拷贝的基因，需要筛选105株转基因植株，工作量非常大。

    Q3：什么是TA基因克隆方法（Original TA Cloning Kit）?

A3：利用聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3’端自动添加一个3’-A突出端。然后利用一个线性含3’-T突出端的载体旧可以直接高效地连接PCR产物。所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行基因克隆。

    Q4：基因克隆时选择连接酶的原则？

A4：体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是常选的酶，因其能在正常的反应条件下有效的将平端连接起来。

   Q5：基因克隆时选择内切酶时的注意事项？

A5：在基因克隆设计时尽量使用好切的内切酶，通常是效价高、便宜量大的酶，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大，至少保持60%的活性。

    Q6：如何在基因克隆实验中检验酶切是否*?

A6：根据酶切产物大小评判。例如原来的重组质粒是3000 bp，酶切后，跑出来两条少于3000 bp的条带，就说明酶切*了，如果不*的话电泳还会跑出3000 bp的条带。

    Q7：低产量或无转化子的原因?

A7：可能有以下几个原因：

(1)  转化效率低。这可能是由于大肠杆菌感受态细胞转化率低或者大肠杆菌无法忍受克隆序列引起，还有可能是电转化前未除去连接酶和/或PEG，连接酶没有热失活，连接酶反应的连接酶过量等原因引起转化效率低

(2)  DNA质量低。DNA含有污染或者凝胶切割回收时，DNA被UV光损害

(3)  DNA末端不匹配。在选择限制酶时匹配不正确或者是载体和插入片段未磷酸化，PCR产物切割效率低，克隆时使用的工具酶受到污染等。

(4)  空载体。载体自身环化切割不*造成。

(5)  结构不正确。非特异性PCR产物克隆，或者由于内切或外切核酸酶污染使得插入片段断裂。

(6)  克隆的插入片段序列错误。PCR使用的DNA聚合酶保真性低，凝胶切割回收时DNA被UV光损害，PCR引物错误。

(7)  克隆不含质粒。琼脂培养基中抗生素含量不够或者卫星克隆。

    Q8：怎样挑选阳性重组DNA？

A8：1、将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成单菌落；2、酶切鉴定：挑取的初步阳性克隆菌在培养基中培养，纯化质粒，进行双酶切鉴定。如果酶切出来有两条带，其中一条和目的基因长度相似，另一条带与质粒大小相似，则二次鉴定为阳性克隆；3、最后，将重组质粒送检测序，如果能得到目的基因序列，则最终确定重组成功。

    Q9：基因克隆中质粒DNA的小量制备？

A9：常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。常用的为碱裂解法，原理是：在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。目前，SunShineBio的商品化质粒小量提取试剂盒可以帮助您回收高质量、高效率的质粒。

    Q10：基因克隆实验中所需试剂？

A10：1、PCR基因扩增仪；恒温振荡培养箱；超净工作台；细菌恒温培养箱；台式高速离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；电泳仪；电泳槽，样品槽模板（梳子）；紫外灯；保鲜膜；一次性塑料手套；凝胶自动成像仪。

2、三角烧瓶，培养皿，玻璃试管，试管塞，玻璃棒，酒精灯，镊子，脱脂棉，纱布，乙醇，容器盒。

3、微量加样器；Tip头；Tip头盒；Eppendorff管；Eppendorff管架。Parafilm，透明胶带。

4、DNA重组相关试剂：

(1).Taq DNA聚合酶，缓冲液，dNTP，特异性引物，靶DNA；凝胶回收试剂盒；TA克隆载体：感受态细胞；氨苄青霉素（100mg/ml）。

(2).LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，10N NaOH调pH至7.0定容至1 L。15磅高压消毒，4 ℃保存。

(3).LB琼脂培养基：15 g琼脂粉溶于1000 ml LB培养基，15磅高压消毒备用。

5．质粒提取试剂或者质粒提取试剂盒：

溶液Ⅰ(10×)：0.5 M葡萄糖；0.25 M Tris-Cl (pH8.0)；0.1 M EDTA，10磅高压消毒，4 ℃保存备用。

溶液Ⅱ：0.2M NaOH；1% SDS 室温贮存，即用即配。

溶液Ⅲ：3M NaOAc (pH4.8) 10磅高压消毒，室温贮存。

RNA酶 A：10 mg/ml

TE缓冲液：10 mM Tris-Cl (pH7.6)，1 mM EDTA(pH8.0)

6．质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳相关试剂：SunShineBio即用缓冲液；限制性内切酶及酶反应所需缓冲液；琼脂糖；溴化乙啶贮存液（10 mg/ml）；6×载样缓冲液。

50×Tris-乙酸(TAE)贮存液：242 g Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）加水至1 L。

Q11：基因克隆实验中SunShineBio可以提供哪些试剂产品

A11：（1） 核酸试剂盒：SunShineBio质粒小量抽提试剂盒、无内毒素质粒小量抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、电泳Marker。（2）生化试剂及即用试剂：1 M Tris-HCl（pH8.0）、10×TAE Buffer、5×TBE Buffer、EB染料、6×Surcose DNA Loading Buffer、琼脂、氨苄青霉素、Tris Base等。