摘要： 电穿孔和电融合技术在生命科学领域的重要性、基本原理以及具体操作流程。通过深入分析这两项技术的机制和步骤，为相关研究人员提供全面且深入的理论支持和实践指导，促进其在细胞操作、基因转染、遗传改良等方面的应用和发展。
在生命科学的快速发展进程中，电穿孔和电融合技术作为先进的细胞操作手段，发挥着不可缺失的作用。它们为细胞生物学、分子生物学、遗传学等多个领域的研究提供了强有力的工具，使我们能够在细胞水平上进行精确的操作和研究，深入理解细胞的生理功能、遗传特性以及细胞间的相互作用。本文将对这两项技术的原理及流程进行深入探讨。
电穿孔技术基于细胞膜的电学特性和对电场的响应机制。细胞膜作为细胞的重要屏障，具有一定的电容和电阻特性。当细胞处于外加电场中时，细胞膜两侧会形成跨膜电位差。随着电场强度的增加和作用时间的延长，跨膜电位差逐渐增大。当达到一个临界值时，细胞膜的脂质双层结构会发生局部扰动，形成一些微小的孔隙，这一现象被称为电穿孔。这些孔隙的形成使得细胞内外的物质能够通过细胞膜进行交换，从而为外源物质（如 DNA、RNA、蛋白质等）进入细胞提供了通道。
选择合适的细胞类型：根据实验目的和要求，选取具有特定生物学特性的细胞，如原代细胞、细胞系等。
细胞培养：将细胞接种于适宜的培养基中，在合适的温度、湿度和气体环境下进行培养，使其处于良好的生长状态并达到一定的细胞密度。通常在细胞对数生长期进行电穿孔操作，此时细胞活性较高，对电穿孔的耐受性相对较好。
收集细胞：用胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养容器表面分离下来，然后通过离心等方法收集细胞沉淀，并用适当的缓冲液（如磷酸盐缓冲液 PBS）洗涤细胞，以去除培养基中的杂质和血清成分，避免其对电穿孔过程产生干扰。
选择合适的缓冲液成分：电穿孔缓冲液的主要作用是维持细胞的渗透压和离子平衡，同时提供适宜的离子环境以促进电穿孔的发生。常用的缓冲液成分包括无机盐（如 NaCl、KCl 等）、糖类（如葡萄糖）和缓冲剂（如 Hepes 等）。根据不同的细胞类型和实验需求，可以对缓冲液的成分和浓度进行优化调整。
调整 pH 值和渗透压：将缓冲液的 pH 值调节至与细胞内环境相近的范围（一般为 7.2 - 7.4），以保证细胞在缓冲液中的活性和稳定性。同时，通过添加适量的溶质来调整缓冲液的渗透压，使其与细胞内液渗透压相当，防止细胞在电穿孔过程中因渗透压变化而受到损伤。例如，对于大多数哺乳动物细胞，缓冲液的渗透压可调整在 280 - 320 mOsm/kg 之间。
过滤除菌：将配制好的电穿孔缓冲液通过 0.22 µm 或 0.45 µm 的滤膜进行过滤除菌，以去除缓冲液中的细菌和其他微生物污染物，确保电穿孔过程在无菌条件下进行。
电场强度：电场强度是电穿孔过程中的关键参数之一，它直接影响电穿孔的效果和细胞的存活率。电场强度的选择应根据细胞类型、细胞大小、缓冲液成分以及外源物质的性质等因素进行优化。一般来说，较小的细胞和较低浓度的外源物质需要较高的电场强度，而较大的细胞和较高浓度的外源物质则需要相对较低的电场强度。电场强度的单位通常为伏特 / 厘米（V/cm），其取值范围在几百到几千 V/cm 之间。对于常见的哺乳动物细胞，电场强度一般在 500 - 1500 V/cm 之间。
脉冲宽度：脉冲宽度是指电场作用于细胞的时间长度，它也对电穿孔效果有重要影响。较长的脉冲宽度可以增加孔隙的形成和维持时间，有利于外源物质的进入，但同时也会增加细胞的损伤风险；较短的脉冲宽度则可能导致孔隙形成不完整，影响电穿孔效率。脉冲宽度的单位通常为微秒（µs）或毫秒（ms），其取值范围在几个微秒到几十毫秒之间。对于大多数细胞，脉冲宽度在 10 - 50 µs 之间较为合适。
脉冲次数：脉冲次数是指电场对细胞施加脉冲的次数。增加脉冲次数可以提高电穿孔效率，但也会进一步增加细胞的损伤程度。因此，脉冲次数的选择需要在电穿孔效率和细胞存活率之间进行平衡。一般情况下，脉冲次数在 1 - 5 次之间较为常见。
设置电击杯类型：根据实验需要选择合适的电击杯，电击杯的尺寸和形状会影响电场的分布和细胞的排列方式。常见的电击杯有不同的容量（如 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL 等）和电极间距，应根据细胞数量和电穿孔仪的要求进行选择。
将细胞悬浮于电穿孔缓冲液中：将收集并洗涤好的细胞沉淀重新悬浮于适量的电穿孔缓冲液中，调整细胞浓度至合适的范围（一般为 1×10⁶ - 1×10⁷ 个 /mL）。细胞浓度过高会导致细胞之间相互作用增强，影响电场分布和电穿孔效果；细胞浓度过低则会浪费外源物质和实验资源。
加入外源物质：将需要导入细胞的外源物质（如 DNA 质粒、RNA 分子、蛋白质等）加入到细胞悬浮液中，轻轻混匀。外源物质的加入量应根据实验目的和细胞类型进行优化，过多的外源物质可能会对细胞产生毒性，而过少则可能无法达到预期的实验效果。
将细胞 - 外源物质混合液转移至电击杯：使用移液器将细胞 - 外源物质混合液小心地转移至预先冷却的电击杯中，避免产生气泡。确保混合液均匀分布在电击杯的电极之间，以保证电场能够均匀作用于细胞。
进行电穿孔操作：将电击杯正确插入电穿孔仪的插槽中，按照设定好的参数启动电穿孔仪进行电击操作。在电击过程中，应密切观察电穿孔仪的运行状态和电击杯中的细胞情况，确保操作顺利进行。
电穿孔后处理：电击完成后，立即将电击杯从电穿孔仪中取出，将细胞悬浮液转移至预先准备好的含有适量培养基的培养容器中（如培养皿、培养瓶等）。将培养容器放置在细胞培养箱中，在合适的条件下进行培养，使细胞恢复生长并表达导入的外源物质。在培养过程中，应定期观察细胞的生长状态和存活情况，并根据需要进行后续的实验分析和检测。
电融合技术是利用电场诱导细胞之间发生融合的方法。当两个或多个细胞在适当的电场作用下紧密接触时，细胞膜会发生极化现象，使得细胞的接触区域形成局部的高电场强度区域。在这种高电场强度的作用下，细胞膜的脂质双层结构会发生紊乱和重排，导致细胞膜的通透性增加并逐渐融合在一起，最终形成一个融合细胞。电融合技术可以实现同种细胞之间的融合（如体细胞融合），也可以用于不同种细胞之间的融合（如细胞杂交），为细胞工程和遗传操作提供了一种有效的手段。
细胞来源和类型选择：与电穿孔技术类似，根据实验目的选择合适的细胞来源和类型。例如，在进行体细胞融合实验时，可以选取来自同一组织或器官的不同类型的体细胞；在进行细胞杂交实验时，则需要选择具有不同遗传特性的两种细胞进行融合。
细胞培养和处理：对选取的细胞进行培养，使其达到良好的生长状态和适宜的细胞密度。在进行电融合操作前，需要对细胞进行适当的处理，以提高细胞的融合效率。例如，可以使用胰蛋白酶等消化酶将细胞制成单细胞悬液，并通过离心和洗涤等步骤去除细胞表面的杂质和残留的培养基成分。此外，还可以对细胞进行预处理，如用某些化学试剂（如聚乙二醇 PEG）或生物因子（如仙台病毒）处理细胞，使细胞的细胞膜变得更加柔软和易于融合。
缓冲液成分选择：电融合缓冲液的成分与电穿孔缓冲液类似，但通常需要根据细胞融合的特点进行一些调整。除了包含维持细胞渗透压和离子平衡的无机盐、糖类和缓冲剂外，还可以添加一些有助于细胞融合的成分，如钙离子（Ca²⁺）等。钙离子可以促进细胞膜的融合过程，提高融合效率。
pH 值和渗透压调节：将电融合缓冲液的 pH 值调节至适宜的范围（一般为 7.0 - 7.4），以保证细胞在缓冲液中的活性和稳定性。同时，调整渗透压使其与细胞内液渗透压相近，通常在 280 - 320 mOsm/kg 之间。
过滤除菌：采用与电穿孔缓冲液相同的方法对电融合缓冲液进行过滤除菌，确保缓冲液的无菌性。
交流电场参数：在电融合过程中，首先需要施加一个交流电场，其作用是使细胞在电场中排列成串，并促进细胞之间的紧密接触。交流电场的参数包括电压、频率和作用时间。电压的选择应根据细胞类型和大小进行调整，一般在几十伏到几百伏之间。频率通常在几百赫兹到几千赫兹之间，作用时间为几十秒到几分钟不等。较高的电压和频率可以使细胞更快地排列成串，但也可能对细胞造成损伤；较低的电压和频率则需要较长的作用时间，但细胞的存活率相对较高。因此，需要在实验中对这些参数进行优化，以找到适合的条件。
直流脉冲电场参数：在细胞排列成串并紧密接触后，需要施加一个直流脉冲电场来诱导细胞膜的融合。直流脉冲电场的参数主要包括电场强度、脉冲宽度和脉冲次数。电场强度一般在几百伏 / 厘米到几千伏 / 厘米之间，脉冲宽度在几十微秒到几百微秒之间，脉冲次数通常为 1 - 3 次。这些参数的选择也需要根据细胞类型、细胞状态以及实验目的进行优化，以获得较高的融合效率和细胞存活率。
将细胞悬浮于电融合缓冲液中：将经过处理的细胞以适当的浓度悬浮于电融合缓冲液中，细胞浓度一般为 1×10⁶ - 1×10⁷ 个 /mL。确保细胞悬浮液均匀，避免细胞团聚。
将细胞悬浮液加入电融合室：使用移液器将细胞悬浮液小心地加入到电融合室中，电融合室通常是一个具有特殊电极结构的容器，可以在电场作用下实现细胞的排列和融合。加入细胞悬浮液时应注意避免产生气泡，以免影响电场分布和细胞融合效果。
施加交流电场：启动电融合仪，按照设定好的交流电场参数施加交流电场。在交流电场的作用下，细胞会逐渐排列成串，并相互紧密接触。观察细胞在电融合室中的排列情况，确保细胞排列均匀且紧密接触。如果细胞排列不理想，可以适当调整电场参数或重新进行操作。
施加直流脉冲电场：当细胞排列成串并紧密接触后，切换到直流脉冲电场模式，按照设定好的参数施加直流脉冲电场。在直流脉冲电场的作用下，细胞膜会发生融合，形成融合细胞。在施加直流脉冲电场过程中，应密切观察细胞的融合情况和电融合仪的运行状态，确保操作顺利进行。
融合后处理：电融合操作完成后，将融合细胞从电融合室中取出，转移至含有适宜培养基的培养容器中进行培养。培养条件应根据融合细胞的类型和特性进行调整，以促进融合细胞的生长和增殖。在培养过程中，需要定期观察融合细胞的生长状态和融合效果，并进行后续的实验分析和检测，如融合细胞的形态观察、染色体分析、基因表达检测等，以评估电融合技术的效果和融合细胞的生物学特性。
电穿孔和电融合技术作为生命科学领域中重要的细胞操作技术，具有广泛的应用前景和深远的研究意义。通过深入理解其原理和掌握详细的操作流程，我们能够更加准确地运用这两项技术进行细胞工程、基因治疗、遗传改良等方面的研究和应用。然而，这两项技术在实际应用中仍面临一些挑战，如电穿孔和电融合效率的进一步提高、细胞存活率的优化、对不同细胞类型的适用性拓展等。未来的研究需要不断探索和创新，进一步完善这两项技术的理论和方法，使其在生命科学研究和实际应用中发挥更大的作用，为推动生命科学的发展做出更大的贡献。
