如何获取更佳的 siRNA 转染效果

一、引言

二、影响 siRNA 转染效果的因素

（一）细胞因素

1. 细胞类型
   不同类型的细胞具有不同的形态、生理特性和膜结构，这直接影响了它们对 siRNA 的摄取能力和转染效率。例如，一些贴壁细胞如 HeLa 细胞、293T 细胞等相对容易转染，而某些原代细胞或悬浮细胞则转染难度较大。这是因为贴壁细胞通常具有较为活跃的内吞作用和较好的细胞附着性，有利于转染试剂与细胞的相互作用；而原代细胞和悬浮细胞可能具有更复杂的细胞表面受体和更严格的细胞内环境调控机制，导致 siRNA 难以进入细胞内部。

2. 细胞生长状态
   细胞的生长状态对 siRNA 转染效果也有显著影响。处于对数生长期的细胞代谢活跃、增殖能力强，此时细胞膜的流动性和通透性较好，更有利于 siRNA 的摄取和转染。相反，处于静止期或老化状态的细胞，其代谢活性降低，细胞膜的功能和结构发生改变，转染效率会明显下降。因此，在进行 siRNA 转染实验前，确保细胞处于良好的对数生长期是获取更佳转染效果的重要前提。

（二）siRNA 因素

1. siRNA 序列设计
   siRNA 的序列决定了其与靶基因 mRNA 的互补性和特异性，是影响转染效果和基因沉默效率的关键因素之一。一个设计合理的 siRNA 序列应具备以下特点：

• 高度的特异性：能够准确识别并结合靶基因 mRNA，避免与非靶基因发生非特异性结合，从而减少脱靶效应。

• 合适的 GC 含量：一般来说，siRNA 的 GC 含量在 40% - 60% 之间较为适宜。GC 含量过高可能导致 siRNA 二级结构过于稳定，影响其与 RNA 诱导沉默复合体（RISC）的结合和作用；GC 含量过低则可能使 siRNA 稳定性下降，容易被核酸酶降解。

• 避免内部重复序列和发卡结构：内部重复序列和发卡结构可能导致 siRNA 自身形成二聚体或高级结构，影响其转染效率和基因沉默效果。

2. siRNA 浓度
   siRNA 的浓度过高或过低都会影响转染效果和基因沉默效率。过高的 siRNA 浓度可能会引起细胞毒性，导致细胞死亡或生长抑制，同时也增加了非特异性相互作用的风险；而过低的 siRNA 浓度则可能无法达到有效的基因沉默水平。因此，在进行转染实验时，需要通过预实验确定合适的 siRNA 浓度范围，以平衡基因沉默效果和细胞毒性之间的关系。

（三）转染试剂因素

1. 转染试剂类型
   目前市场上有多种类型的转染试剂可供选择，如脂质体转染试剂、阳离子聚合物转染试剂、病毒载体转染试剂等。不同类型的转染试剂具有不同的转染机制和特点，其适用的细胞类型和 siRNA 也有所差异。例如，脂质体转染试剂通过与细胞膜融合将 siRNA 包裹进入细胞内，具有转染效率高、适用范围广的优点，但可能存在一定的细胞毒性；阳离子聚合物转染试剂则通过与 siRNA 形成复合物，利用静电作用吸附到细胞表面并进入细胞，其细胞毒性相对较低，但转染效率可能受到细胞类型和培养条件的影响。因此，根据实验需求和细胞特点选择合适的转染试剂是获取更佳转染效果的重要环节。

2. 转染试剂质量
   转染试剂的质量直接关系到转染实验的成败。优质的转染试剂应具有高纯度、稳定的化学性质和良好的生物相容性。低质量的转染试剂可能含有杂质或降解产物，这些物质可能会对细胞产生毒性作用，影响细胞的正常生理功能和 siRNA 的转染效果。此外，转染试剂的保存条件和有效期也需要严格遵守，以确保其性能的稳定性和可靠性。

（四）转染条件因素

1. 转染试剂与 siRNA 的比例
   转染试剂与 siRNA 的比例是影响转染复合物形成和转染效率的重要因素之一。不同的转染试剂和细胞类型对比例的要求有所不同。一般来说，需要通过优化实验确定最佳的转染试剂与 siRNA 比例，以确保形成稳定且具有高效转染能力的转染复合物。比例过高可能导致转染复合物过于稳定而难以进入细胞，或者引起细胞毒性；比例过低则可能使转染复合物不稳定，无法有效地将 siRNA 递送到细胞内。

2. 转染时间和温度
   转染时间和温度也会对 siRNA 转染效果产生影响。转染时间过长可能会增加细胞毒性和非特异性作用的风险，而过短则可能导致 siRNA 无法充分进入细胞。转染温度应根据转染试剂和细胞类型的要求进行设置，一般在 37℃左右，但对于某些特殊的细胞或转染试剂，可能需要适当调整温度以提高转染效率。例如，一些脂质体转染试剂在较低温度下与 siRNA 形成复合物，然后再升温到 37℃进行转染，能够提高转染效率并降低细胞毒性。

3. 细胞培养环境
   细胞培养环境中的血清成分、抗生素浓度、pH 值等因素也可能影响 siRNA 转染效果。血清中的某些蛋白质可能会与转染试剂或 siRNA 相互作用，影响转染复合物的形成和稳定性。因此，在进行转染实验时，有些转染试剂需要在无血清或低血清条件下进行转染，然后在转染后适当时间再补充血清。此外，过高或过低的抗生素浓度和不合适的 pH 值也可能对细胞状态和转染效果产生不利影响，需要在实验过程中进行严格控制。

三、优化 siRNA 转染效果的策略

（一）细胞培养与处理

1. 细胞选择与培养
   在进行 siRNA 转染实验前，根据研究目的和实验要求选择合适的细胞类型。对于转染难度较大的细胞，如原代细胞或悬浮细胞，可以尝试采用一些特殊的培养方法或添加细胞因子等辅助试剂来提高细胞的转染效率。同时，确保细胞在培养过程中处于良好的生长状态，定期传代培养，避免细胞老化和污染。

2. 细胞预处理
   在转染前，可以对细胞进行适当的预处理，以增强细胞对 siRNA 的摄取能力。例如，使用胰蛋白酶消化细胞后，重新接种细胞并使其在转染前恢复一段时间，这样可以使细胞处于更活跃的状态，有利于转染。另外，一些研究表明，在转染前对细胞进行短暂的低渗处理或使用细胞松弛素 B 等药物处理，可以增加细胞膜的通透性，提高 siRNA 的转染效率。但需要注意的是，这些预处理方法可能会对细胞产生一定的影响，需要在实验中进行优化和控制。

（二）siRNA 设计与合成

1. 优化 siRNA 序列
   借助生物信息学工具和相关数据库，对 siRNA 序列进行设计和优化。在选择靶基因序列时，应尽量避开 mRNA 的非编码区和高度保守区域，选择具有较高特异性的区域作为 siRNA 的靶位点。同时，通过软件预测 siRNA 的二级结构和热力学性质，避免设计出具有不稳定结构或过高能量的序列。此外，可以设计多条针对同一靶基因的 siRNA 序列，并进行预实验筛选出沉默效果佳的序列用于后续实验。

2. 化学修饰 siRNA
   为了提高 siRNA 的稳定性和转染效率，减少免疫原性和脱靶效应，可以对 siRNA 进行化学修饰。常见的化学修饰包括磷酸骨架修饰、核糖修饰和碱基修饰等。例如，将 siRNA 的磷酸骨架部分替换为硫代磷酸酯，可以增强 siRNA 对核酸酶的抗性，提高其稳定性；对核糖进行 2'-O - 甲基修饰或氟代修饰，可以改善 siRNA 的药代动力学性质和与 RISC 的结合能力。但需要注意的是，化学修饰可能会对 siRNA 的活性产生一定影响，需要在实验中进行评估和优化。

（三）转染试剂选择与优化

1. 转染试剂筛选
   根据细胞类型、实验目的和预算等因素，筛选适合的转染试剂。可以参考其他科研人员的经验和相关文献报道，同时进行小规模的转染试剂筛选实验。在实验中，比较不同转染试剂对细胞的毒性、转染效率和基因沉默效果，选择综合性能最佳的转染试剂。此外，一些转染试剂供应商提供了针对不同细胞类型的优化转染方案和技术支持，可以充分利用这些资源来提高转染实验的成功率。

2. 转染试剂优化
   在确定转染试剂后，对其使用条件进行优化。包括调整转染试剂与 siRNA 的比例、优化转染时间和温度、探索适合的细胞培养环境等。可以通过设置一系列的梯度实验，分别考察不同条件对转染效果的影响，然后根据实验结果确定最佳的转染条件。同时，注意在实验过程中严格按照转染试剂说明书的要求进行操作，确保实验的准确性和可重复性。

（四）转染实验操作与质量控制

1. 实验操作规范
   在进行 siRNA 转染实验时，严格遵守实验操作规范，确保实验过程的准确性和稳定性。例如，在配制转染复合物时，应按照正确的顺序和比例将转染试剂与 siRNA 混合，并在规定的时间内完成操作，避免复合物的过早形成或降解。在加入转染复合物到细胞培养液中时，应缓慢均匀地滴加，避免产生气泡和对细胞造成冲击。此外，实验过程中应使用无菌的试剂和耗材，防止细胞污染对转染效果产生影响。

2. 质量控制与检测
   建立完善的质量控制体系，对 siRNA 转染实验的各个环节进行质量检测和评估。在实验前，对 siRNA 的质量进行检测，包括浓度、纯度和完整性等指标。可以使用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。在转染过程中，定期观察细胞的形态和生长状态，及时发现并处理可能出现的细胞毒性和污染问题。转染后，通过检测基因沉默效果来评估转染实验的成功与否。常用的检测方法包括实时荧光定量 PCR（qPCR）、Western blot、免疫荧光染色等。同时，设置合理的对照实验，如阴性对照（转染无关 siRNA 或不转染 siRNA）和阳性对照（使用已知有效的 siRNA 或基因沉默方法），以确保实验结果的可靠性和准确性。

四、结论