电激法导入外源基因植物基因改造新章

一、引言

在植物基因工程领域，导入外源基因是实现植物性状改良和功能研究的关键步骤。传统的基因导入方法如农杆菌介导法和基因枪法等在某些情况下存在局限性，例如农杆菌的宿主范围限制和基因枪转化成本较高等问题。电激法作为一种新兴的基因导入技术，为植物基因改造带来了新的机遇。电激法利用短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成可逆的微孔，从而使外源基因能够穿过细胞膜进入细胞内部。这种方法具有操作相对简单、不受植物种类限制、可同时处理多个细胞等优点，为植物基因改造研究开辟了新的途径。

二、电激法导入外源基因的原理

（一）细胞膜的电学性质

植物细胞膜具有一定的电容和电阻特性。在正常情况下，细胞膜作为一种半透性屏障，阻止大分子物质如外源基因的自由进出。然而，当施加高压电脉冲时，细胞膜两侧的电位差会发生急剧变化，导致细胞膜的脂质双分子层结构发生改变。

（二）电穿孔现象

高压电脉冲引起细胞膜脂质双分子层中的疏水区域重新排列，形成瞬间的、可逆的微孔，这一过程被称为电穿孔。这些微孔的大小和数量取决于电脉冲的强度、持续时间和脉冲次数等参数。当外源基因存在于细胞周围的介质中时，它们可以通过这些微孔进入细胞内部，实现基因的导入。

（三）细胞的恢复与基因整合

电穿孔形成后，在电脉冲结束后的短时间内，细胞膜具有自我修复能力，微孔会逐渐闭合。进入细胞内的外源基因可以通过细胞内的各种机制进行转运和整合到植物基因组中，从而实现基因的稳定表达和遗传。

三、电激法导入外源基因的实验方法

（一）植物材料的准备

植物组织的选择

选择合适的植物组织对于电激法的成功至关重要。一般来说，幼嫩的叶片、愈伤组织、悬浮细胞等都是常用的材料。例如，对于双子叶植物，幼嫩叶片的表皮细胞和叶肉细胞具有较高的再生能力和基因导入潜力。对于单子叶植物，愈伤组织或悬浮培养细胞可能更有利于基因导入和后续的培养。

植物材料的预处理

采集的植物组织需要进行预处理以提高电激转化效率。对于叶片组织，通常先用无菌水清洗，然后用消毒剂（如次氯酸钠溶液）进行表面消毒，再用无菌水冲洗干净。对于愈伤组织和悬浮细胞，需要在合适的培养基中进行预培养，使其处于活跃的生长状态。预培养的培养基成分根据不同植物种类进行优化，一般包括适量的碳源、氮源、无机盐和植物生长调节剂等。

（二）外源基因的准备

基因载体的构建

选择合适的基因载体来携带外源基因。常见的载体包括质粒载体，如 pBI121 等。在构建载体时，将目的基因（如抗虫基因、抗病基因或具有特定生理功能的基因）插入到载体的合适位置，同时还需要包含启动子、终止子等调控元件。启动子的选择对于基因在植物中的表达水平至关重要，常用的启动子有 CaMV 35S 启动子等，它可以在多种植物中驱动基因的高效表达。

外源基因的纯度和浓度

获得高纯度的外源基因是保证电激转化效率的关键之一。通过基因克隆、提取和纯化等步骤，确保基因溶液中没有杂质。外源基因的浓度也需要进行优化，一般在微克每微升级别。浓度过低可能导致转化效率低下，而浓度过高可能对细胞造成损伤。

（三）电激参数的优化

电脉冲强度

电脉冲强度是影响电穿孔效果的重要因素。一般通过实验来确定最佳的脉冲强度，通常在几百伏到几千伏每厘米的范围内。对于不同的植物材料和细胞类型，合适的脉冲强度有所不同。例如，对于一些薄壁细胞较多的植物组织，较低的脉冲强度可能就足以形成有效的电穿孔，而对于细胞壁较厚或细胞结构较为复杂的植物材料，可能需要更高的脉冲强度。

脉冲持续时间和脉冲次数

脉冲持续时间通常在微秒到毫秒级别。较短的脉冲持续时间可能不足以形成足够大的微孔让外源基因进入，而过长的持续时间可能会对细胞造成不可逆的损伤。脉冲次数一般在 1 - 10 次之间，多次脉冲可以增加电穿孔的效率，但也需要注意避免过度损伤细胞。通过设计一系列的实验，改变脉冲持续时间和脉冲次数，观察基因导入效率和细胞存活率，来确定最佳的参数组合。

（四）电激处理过程

电激缓冲液的选择

选择合适的电激缓冲液对于维持细胞的生理状态和提高基因导入效率至关重要。缓冲液的成分一般包括适量的无机盐（如氯化钠、氯化钙等）、缓冲剂（如 HEPES）和糖类（如甘露醇）等。这些成分有助于维持细胞的渗透压、离子平衡和 pH 值，减少电脉冲对细胞的损伤。

电激操作

将预处理后的植物组织或细胞与含有外源基因的溶液混合，置于电激杯中。电激杯通常具有两个电极，将其连接到电激仪上。根据优化好的电脉冲强度、持续时间和脉冲次数等参数，对细胞进行电激处理。在电激过程中，要确保细胞与电极充分接触，以保证电脉冲能够均匀地作用于细胞。

（五）电激后处理与筛选

细胞培养与恢复

电激处理后，将植物组织或细胞转移到合适的恢复培养基中进行培养。恢复培养基的成分与预培养培养基相似，但可能需要添加一些促进细胞修复和生长的物质，如氨基酸、维生素等。在恢复培养过程中，细胞可以修复电穿孔造成的损伤，同时外源基因有机会整合到植物基因组中。

筛选转化体

为了筛选出成功导入外源基因的植物细胞或组织，需要采用合适的筛选方法。常用的筛选标记基因包括抗生素抗性基因或除草剂抗性基因等。在恢复培养基中添加相应的抗生素或除草剂，只有成功导入含有筛选标记基因的外源基因的细胞才能存活和生长。通过连续的筛选和培养，可以获得稳定的转基因植物细胞系或再生植株。

四、电激法的优势

（一）广泛的适用性

电激法不受植物种类的限制，无论是双子叶植物还是单子叶植物，甚至一些难以用传统方法转化的植物都可以尝试使用电激法进行基因导入。这使得电激法在植物基因工程领域具有更广泛的应用前景，为研究各种植物的基因功能和性状改良提供了可能。

（二）操作简便性

相较于一些复杂的基因导入方法，电激法的操作相对简单。它不需要复杂的生物试剂（如农杆菌）或昂贵的设备（如基因枪），只需要一台电激仪和基本的实验室条件即可开展实验。这降低了实验成本和技术门槛，有利于更多的研究人员开展植物基因改造研究。

（三）可同时处理多个细胞

电激法可以同时对大量的细胞进行处理，提高了基因导入的效率。在电激过程中，只要细胞处于合适的电场范围内，都有机会被电穿孔并导入外源基因。这种批量处理能力对于需要大量转基因材料的研究，如基因功能的大规模筛选等具有重要意义。

五、电激法的挑战与限制

（一）细胞损伤问题

虽然电穿孔是可逆的，但如果电脉冲参数设置不当，很容易对细胞造成不可逆的损伤，导致细胞死亡或生长异常。这种损伤不仅会影响基因导入效率，还可能影响后续转基因植物的生长和发育。因此，精确优化电脉冲参数对于减少细胞损伤至关重要。

（二）基因整合的随机性

外源基因通过电激法导入细胞后，其在植物基因组中的整合位置是随机的。这种随机性可能会导致基因表达的不稳定性或产生意想不到的基因沉默现象。此外，随机整合还可能破坏植物原有的基因功能，对植物的生长和发育产生负面影响。因此，需要进一步研究如何控制外源基因的整合位置和方式。

（三）转化效率的提高

尽管电激法具有一定的优势，但目前其转化效率在某些情况下仍然相对较低，尤其是对于一些复杂的植物基因组或特定的植物组织。提高转化效率仍然是电激法在植物基因改造中需要解决的关键问题之一，需要从植物材料预处理、电激参数优化、外源基因载体设计等多个方面进行深入研究。

六、电激法在植物基因改造中的应用前景

（一）作物性状改良

通过电激法导入抗虫、抗病、抗逆等相关基因，可以培育出具有优良性状的农作物新品种。例如，将 Bt 抗虫基因导入水稻、玉米等作物中，可以提高作物对害虫的抵抗力，减少农药的使用，实现绿色农业生产。同时，导入耐盐、耐旱等抗逆基因可以使作物在恶劣的环境条件下生长，扩大作物的种植范围。

（二）植物功能基因组学研究

电激法可以用于将报告基因（如 GFP 绿色荧光蛋白基因）导入植物细胞，通过观察报告基因的表达模式来研究基因的启动子活性、基因表达的时空特异性等。此外，通过导入功能缺失或过表达的基因，可以分析基因在植物生长、发育和生理过程中的功能，为植物功能基因组学研究提供有力的工具。

（三）药用植物基因工程

对于一些药用植物，可以利用电激法导入合成药用成分相关的基因，提高药用成分的含量和产量。例如，在人参、丹参等药用植物中导入相关基因，有望增加其有效成分的积累，提高药用价值，为医药产业提供更多的优质原料。

七、结论

电激法作为一种新兴的植物基因导入技术，在植物基因改造领域展现出了更好的优势和巨大的潜力。通过深入研究其原理和优化实验方法，我们可以克服目前面临的挑战，进一步提高电激法的转化效率和基因整合的可控性。随着技术的不断发展，电激法有望在作物性状改良、植物功能基因组学研究和药用植物基因工程等多个领域发挥重要作用，开启植物基因改造的新篇章，为解决全球粮食安全、农业可持续发展和医药资源等问题提供新的途径和方法。在未来的研究中，需要多学科交叉合作，不断完善电激法技术体系，推动植物基因工程领域的进一步发展。