抗菌肽基因转化技术在樱桃砧木上的应用

一、引言

樱桃作为一种深受人们喜爱的水果，在全球水果产业中占据重要地位。然而，樱桃在生长过程中容易受到多种病原菌的侵袭，如细菌、真菌等，这些病害严重影响樱桃的产量和品质，给樱桃种植业带来了巨大的经济损失。传统的化学防治方法虽然在一定程度上能够控制病害，但长期使用容易导致病原菌抗药性的产生，同时也会对环境造成污染。因此，寻找一种环保、高效的病害防治方法成为樱桃产业发展的关键。

抗菌肽作为生物体内天然存在的一类具有抗菌活性的小分子多肽，具有广谱抗菌活性、作用机制更好且不易使病原菌产生抗药性等优点。将抗菌肽基因导入樱桃砧木，有望增强樱桃砧木对病原菌的抵抗力，从而提高樱桃的整体抗病能力。这种基于基因工程的方法为樱桃砧木的遗传改良提供了新的思路和途径。而且，樱桃砧木作为樱桃树生长的基础，其遗传改良对于整个樱桃植株的生长发育和抗病性能具有深远的影响。本研究旨在探索抗菌肽基因转化技术在樱桃砧木上的应用，为樱桃产业的可持续发展提供有力支持。

二、材料与方法

（一）材料

植物材料

选择适宜当地生长环境且具有一定经济价值的樱桃砧木品种作为实验材料，采集其种子或幼苗用于后续实验。

菌株与质粒

从相关菌种保藏中心获取含有目标抗菌肽基因的菌株，同时准备合适的克隆载体和植物表达载体，如常用的 pBI121 等。

酶与试剂

限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA 聚合酶、各种抗生素、卡那霉素、潮霉素等筛选试剂，以及其他分子生物学常用试剂，如 dNTPs、缓冲液等。

（二）抗菌肽基因的克隆

基因组 DNA 提取

从含有目标抗菌肽基因的菌株中提取基因组 DNA。采用经典的 CTAB 法或商业化的基因组 DNA 提取试剂盒，按照操作说明书进行。提取后的 DNA 用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其纯度和浓度，确保 DNA 的质量符合后续实验要求。

引物设计

根据目标抗菌肽基因的序列信息，使用专业的引物设计软件（如 Primer Premier 5）设计特异性引物。引物设计需考虑合适的退火温度、避免引物二聚体和错配等因素。引物两端添加合适的限制性内切酶识别位点，以便后续与载体连接。

PCR 扩增

以提取的基因组 DNA 为模板，加入设计好的引物、dNTPs、DNA 聚合酶和相应的缓冲液进行 PCR 扩增。PCR 反应条件经过优化，包括预变性、变性、退火、延伸等步骤，循环次数根据模板浓度和基因大小进行调整。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否得到预期大小的条带。

（三）植物表达载体的构建

载体的选择与处理

选择合适的植物表达载体，如 pBI121。用特定的限制性内切酶对载体进行双酶切，酶切反应体系根据酶的活性和载体的量进行配制。酶切后的载体通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后使用胶回收试剂盒回收线性化的载体片段。

基因与载体的连接

将克隆得到的抗菌肽基因片段和线性化的植物表达载体在 T4 DNA 连接酶的作用下进行连接。连接反应体系中基因与载体的摩尔比、连接酶的用量和反应时间都经过优化，以提高连接效率。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过含有相应抗生素的 LB 平板进行筛选，挑取单菌落进行培养，提取质粒进行酶切和测序验证，确保抗菌肽基因正确插入到植物表达载体中。

（四）樱桃砧木的转化

农杆菌介导的转化

(1) 农杆菌感受态细胞的制备

选择合适的农杆菌菌株（如 LBA4404），采用氯化钙法或电击法制备感受态细胞。制备好的感受态细胞保存于 - 80℃冰箱备用。

(2) 农杆菌的转化

将构建好的植物表达载体导入农杆菌感受态细胞中，通过热激或电击等方法，然后在含有相应抗生素（如利福平、卡那霉素等）的 YEB 平板上培养，筛选出含有重组质粒的农杆菌单菌落。

(3) 樱桃砧木的侵染

选取生长良好的樱桃砧木幼苗或外植体（如叶片、茎段等），将含有重组质粒的农杆菌菌液稀释至合适的浓度（OD₆₀₀值一般在 0.5 - 0.8 之间）。将樱桃砧木材料浸泡在农杆菌菌液中一定时间（一般为 10 - 30 分钟），期间不断轻轻摇动，使农杆菌与植物材料充分接触。侵染完成后，用无菌滤纸吸干多余的菌液。

基因枪转化法（可选）

(1) 微弹制备

将金粉或钨粉等微弹材料与抗菌肽基因表达载体混合，加入适量的 spermidine 和 CaCl₂等，使基因载体吸附在微弹表面。通过涡旋、离心等操作使微弹均匀分散。

(2) 基因枪轰击

将处理后的樱桃砧木外植体放置在基因枪的轰击室内，设置合适的轰击参数，如轰击压力、距离等。使用基因枪将带有抗菌肽基因的微弹轰击到樱桃砧木细胞内。轰击后的外植体在无菌条件下培养。

（五）转化体的筛选与鉴定

筛选标记基因的利用

利用植物表达载体上的筛选标记基因（如卡那霉素抗性基因），将转化后的樱桃砧木材料接种在含有相应筛选剂（如卡那霉素）的培养基上进行初步筛选。未转化的细胞由于不具有抗性而无法生长，存活的细胞则可能是成功转化的细胞。

分子生物学鉴定

(1) PCR 鉴定

提取筛选后樱桃砧木的基因组 DNA，以其为模板，使用针对抗菌肽基因的特异性引物进行 PCR 鉴定。若能扩增出目标条带，则表明抗菌肽基因可能已整合到樱桃砧木基因组中。

(2) Southern blotting 鉴定

将樱桃砧木基因组 DNA 进行酶切、电泳、转膜等操作，然后用标记的抗菌肽基因探针进行杂交。通过检测杂交信号，可以确定抗菌肽基因在樱桃砧木基因组中的整合情况，包括拷贝数等信息。

(3) Northern blotting 鉴定

提取樱桃砧木的总 RNA，进行电泳、转膜，然后用标记的抗菌肽基因探针进行杂交，检测抗菌肽基因在转录水平的表达情况。

(4) Western blotting 鉴定

提取樱桃砧木的总蛋白，通过 SDS - PAGE 电泳分离蛋白，转膜后用抗抗菌肽的特异性抗体进行免疫杂交，检测抗菌肽在蛋白水平的表达情况，确定抗菌肽是否在樱桃砧木中成功表达。

（六）转化后樱桃砧木的抗病性检测

病原菌接种

选择樱桃生产中常见的病原菌（如樱桃褐腐病菌、樱桃穿孔病菌等），在实验室条件下培养至合适的浓度。采用喷雾接种、刺伤接种或浸根接种等方法将病原菌接种到转化后的樱桃砧木和对照（未转化的樱桃砧木）上。

抗病性评价

接种病原菌后，定期观察樱桃砧木的发病情况，记录发病时间、症状严重程度等。可以采用病情指数评价法，根据病害症状的分级标准（如无症状、轻微症状、中度症状、严重症状等）计算病情指数，比较转化植株和对照植株的抗病能力差异。同时，通过组织病理学观察，如切片观察病原菌在植物组织内的侵染和扩展情况，进一步分析抗菌肽基因转化对樱桃砧木抗病机制的影响。

（七）转化后樱桃砧木的生长特性分析

生长指标测定

在樱桃砧木的生长过程中，定期测量其株高、茎粗、叶面积、根系发育等生长指标。比较转化植株和对照植株在生长速度、生物量积累等方面的差异，评估抗菌肽基因转化对樱桃砧木生长发育的影响。

生理指标测定

测定樱桃砧木的光合作用相关指标（如光合速率、气孔导度、叶绿素含量等）、抗氧化酶活性（如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等）以及其他生理生化指标。分析这些指标的变化，探讨抗菌肽基因转化对樱桃砧木生理功能的影响，以及与抗病性和生长特性之间的关系。

三、结果

（一）抗菌肽基因克隆与载体构建结果

通过 PCR 扩增成功获得了预期大小的抗菌肽基因片段，琼脂糖凝胶电泳显示条带清晰。构建的植物表达载体经酶切和测序验证，抗菌肽基因正确插入到载体的合适位点，且序列与目标基因一致，表明载体构建成功。

（二）樱桃砧木转化结果

农杆菌介导转化

经过农杆菌侵染和筛选，在含有卡那霉素的培养基上获得了一定数量的抗性樱桃砧木苗。这些抗性苗在形态上与未转化苗有一定差异，部分表现出叶片颜色稍深、生长势稍强等特征。

基因枪转化（若进行）

通过基因枪轰击和筛选，也获得了一些可能的转化体，但转化效率相对较低，且转化体的生长状态在初期较不稳定。

（三）转化体的筛选与鉴定结果

PCR 鉴定

对筛选后的樱桃砧木进行 PCR 鉴定，部分植株扩增出了与抗菌肽基因大小相符的条带，初步表明抗菌肽基因可能已整合到这些植株的基因组中。

Southern blotting 鉴定

Southern blotting 结果显示，部分转化植株有杂交信号，进一步证实了抗菌肽基因在樱桃砧木基因组中的整合，并且可以估算出基因的拷贝数，不同转化植株的拷贝数存在一定差异。

Northern blotting 和 Western blotting 鉴定

Northern blotting 结果表明抗菌肽基因在部分转化植株的转录水平有表达，Western blotting 检测到了抗菌肽蛋白的表达，说明抗菌肽基因在樱桃砧木中实现了从基因到蛋白的表达过程。

（四）抗病性检测结果

病原菌接种后观察

在病原菌接种后，对照樱桃砧木在较短时间内出现明显的病害症状，如叶片出现病斑、枝干溃疡等。而转化后的樱桃砧木发病时间明显延迟，症状严重程度较对照轻。病情指数计算结果显示，转化植株的病情指数显著低于对照植株，表明转化后的樱桃砧木对病原菌具有较强的抵抗力。

组织病理学观察

组织病理学观察发现，在病原菌侵染初期，转化植株的细胞壁增厚、胼胝质沉积等防御反应更为明显，病原菌在转化植株组织内的扩展受到明显抑制，进一步证明了抗菌肽基因转化提高了樱桃砧木的抗病能力。

（五）生长特性分析结果

生长指标

在整个生长周期内，转化后的樱桃砧木株高、茎粗、叶面积等生长指标总体上与对照植株有一定差异。部分转化植株的生长速度略有加快，生物量积累有所增加，但也有一些转化植株的生长与对照差异不显著。

生理指标

测定的光合作用相关指标显示，部分转化植株的光合速率、气孔导度和叶绿素含量有所提高。抗氧化酶活性在转化植株中也有不同程度的变化，一些抗氧化酶活性增强，这可能与植株的抗病和生长调节机制有关。

四、讨论

（一）抗菌肽基因转化技术的优势

增强抗病性

本研究结果表明，抗菌肽基因转化显著提高了樱桃砧木对病原菌的抵抗力。抗菌肽的广谱抗菌活性能够有效抑制多种病原菌的侵染和生长，为樱桃砧木提供了一种持久且高效的防御机制，减少了化学农药的使用需求。

潜在的生长促进作用

虽然部分转化植株在生长指标和生理指标上有积极变化，但这种生长促进作用可能是间接的。抗菌肽基因的表达可能通过减少病原菌对植物的损害，使植物能够更好地利用资源进行生长和发育，或者抗菌肽本身对植物的生理过程有一定的调节作用。

（二）存在的问题与挑战

转化效率问题

无论是农杆菌介导转化还是基因枪转化，都存在转化效率不高的问题。在农杆菌介导转化中，可能受到农杆菌菌株、樱桃砧木基因型、侵染条件等多种因素的影响。基因枪转化虽然可以避免农杆菌宿主范围的限制，但操作复杂且对细胞的损伤可能影响转化体的生长和发育。

基因表达稳定性问题

在研究中发现，部分转化植株的抗菌肽基因表达存在一定的波动性。这可能与基因整合位点、表观遗传修饰等因素有关。基因表达不稳定可能会影响樱桃砧木长期的抗病性能，需要进一步研究解决。

多基因协同作用的复杂性

在实际的樱桃抗病过程中，可能需要多种抗菌肽或其他抗病相关基因的协同作用。然而，同时导入多个基因并使其高效表达和协同发挥作用面临着更大的技术挑战，包括载体构建、基因之间的相互作用等问题。

（三）对未来研究的启示

优化转化技术

进一步探索适合樱桃砧木的高效转化方法，通过优化农杆菌侵染条件、改进基因枪参数或开发新的转化技术，提高抗菌肽基因的转化效率。同时，研究减少转化过程中对植物细胞损伤的方法，提高转化体的质量。

深入基因表达调控研究

开展对抗菌肽基因在樱桃砧木中表达调控机制的研究，包括基因启动子活性、转录因子调控、表观遗传修饰等方面。通过这些研究，有望找到稳定基因表达的方法，确保抗菌肽在樱桃砧木中持续有效地发挥作用。

多基因转化策略

针对樱桃复杂的病害环境，研究多基因转化策略。开发合适的多基因表达载体，探索不同抗菌肽基因组合以及与其他抗病相关基因的协同作用，以提高樱桃砧木对多种病原菌的综合抗病能力。

五、结论

本研究成功将抗菌肽基因导入樱桃砧木，并通过多种方法对转化体进行了筛选和鉴定。转化后的樱桃砧木表现出了较强的抗病能力和一定的生长优势。然而，抗菌肽基因转化技术在樱桃砧木应用中仍面临一些问题，如转化效率和基因表达稳定性等。未来需要进一步优化该技术，深入研究基因表达调控机制和开展多基因转化策略研究，以更好地利用抗菌肽基因转化技术改良樱桃砧木，推动樱桃产业的可持续发展。通过本研究为樱桃砧木的遗传改良提供了有价值的参考和实践经验，为解决樱桃病害问题开辟了新的途径。