禾谷类作物外源基因导入与表达研究进展

一、摘要

禾谷类作物外源基因导入与表达的研究现状及进展。详细阐述了常用的外源基因导入方法，包括农杆菌介导法、基因枪法等，以及影响外源基因在禾谷类作物中表达的多种因素，如启动子选择、基因沉默现象等。此外，对目前研究成果在提高作物产量、增强抗逆性等方面的应用进行了讨论，并对未来研究方向提出展望，旨在为禾谷类作物基因工程改良提供全面而深入的参考。

二、引言

禾谷类作物是全球重要的粮食作物，为人类提供了大量的碳水化合物、蛋白质等营养物质。随着人口增长和环境变化，提高禾谷类作物的产量、品质和抗逆性成为保障全球粮食安全的关键挑战。传统的育种方法在一定程度上满足了人类对禾谷类作物改良的需求，但存在周期长、遗传资源有限等局限性。基因工程技术的出现为禾谷类作物的改良提供了新的途径，通过将外源基因导入禾谷类作物，可以赋予其新的优良性状，如抗病虫害、抗逆、提高营养价值等。因此，深入研究禾谷类作物外源基因导入与表达对于推动农业可持续发展具有至关重要的意义。

三、外源基因导入禾谷类作物的方法

（一）农杆菌介导法

原理

农杆菌是一种天然的基因工程载体，其中根癌农杆菌含有 Ti 质粒，发根农杆菌含有 Ri 质粒。当农杆菌感染植物伤口时，Ti 或 Ri 质粒上的 T - DNA 区可以转移并整合到植物基因组中。在基因工程应用中，将目的基因插入到经过改造的 T - DNA 区域，通过农杆菌与禾谷类作物组织的共培养，实现外源基因的导入。

实验步骤

农杆菌菌株的选择与培养：选择适合禾谷类作物转化的农杆菌菌株，如 LBA4404 等。将农杆菌接种于含有相应抗生素的 LB 液体培养基中，在 28℃、200rpm 的条件下振荡培养至对数生长期。

禾谷类作物外植体的准备：选取合适的禾谷类作物组织作为外植体，如水稻的幼胚、玉米的幼穗等。将外植体消毒后，在无菌条件下切成适当大小。

共培养：将处于对数生长期的农杆菌菌液与外植体在共培养基上进行共培养，共培养基中通常含有特定的植物激素和乙酰丁香酮等诱导物质。共培养条件一般为 22 - 25℃、黑暗环境下培养 2 - 3 天。

筛选与再生：共培养结束后，将外植体转移至含有筛选抗生素的再生培养基上，抑制未转化细胞的生长，促进转化细胞的再生。经过多次筛选和继代培养，获得转基因植株。

（二）基因枪法

原理

基因枪法又称微弹轰击法，是利用高速飞行的金属微粒（如金粉或钨粉）将外源 DNA 带入植物细胞。这些金属微粒表面吸附有目的基因，在高压气体或爆炸等动力作用下，微粒高速穿透植物细胞壁和细胞膜，将外源基因导入细胞内。

实验步骤

微弹制备：将金粉或钨粉与外源 DNA、氯化钙、亚精胺等混合，使 DNA 吸附在微弹表面。经过离心、洗涤等步骤，制备成可用于轰击的微弹。

植物材料准备：选择禾谷类作物的幼嫩组织或细胞悬浮培养物作为轰击对象。将植物材料置于培养皿中，固定在基因枪的轰击室内。

轰击参数设置：根据不同的基因枪类型和植物材料，设置合适的轰击压力、距离和次数等参数。例如，对于水稻幼胚，轰击压力可设置为 1100 - 1300psi，轰击距离为 6 - 9cm，轰击次数为 1 - 2 次。

轰击后处理：轰击完成后，将植物材料转移至合适的培养基上进行培养和筛选，方法类似于农杆菌介导法中的再生和筛选步骤。

（三）其他方法

花粉管通道法

在授粉后一定时间内，将含有外源基因的溶液注射到花柱内，使外源基因随着花粉管的伸长进入胚囊，从而实现基因转化。这种方法操作相对简单，但转化效率较低且可重复性较差。

电穿孔法

利用高压电脉冲在植物细胞膜上形成短暂的可逆性小孔，使外源 DNA 能够通过这些小孔进入细胞。该方法需要特定的电穿孔设备，并且对细胞的损伤和处理条件要求较为严格。

四、影响外源基因在禾谷类作物中表达的因素

（一）启动子的选择

启动子是调控基因转录起始的关键元件。在禾谷类作物基因工程中，常用的启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。

组成型启动子

如 CaMV35S 启动子，它可以在植物的各个组织和发育阶段持续驱动基因表达。但在某些情况下，组成型表达可能会导致植物生长发育异常或能量浪费。

组织特异性启动子

例如，水稻谷蛋白基因启动子可以在水稻种子中特异性启动基因表达，将目的基因在特定组织中表达可以更有效地发挥其功能，同时减少对其他组织的不良影响。

诱导型启动子

如受干旱、高温等环境因素诱导的启动子，当植物受到相应胁迫时，启动子被激活，使目的基因表达，增强植物的抗逆性。

（二）基因沉默现象

基因沉默是外源基因在植物中表达过程中常见的问题，主要包括转录水平基因沉默和转录后基因沉默。

转录水平基因沉默

主要是由于 DNA 甲基化、异染色质化等原因，导致基因转录受到抑制。例如，当外源基因插入到基因组中的某些甲基化敏感区域时，可能会发生高度甲基化，从而使基因无法正常转录。

转录后基因沉默

与小 RNA 介导的 RNA 降解机制有关。当外源基因转录产生的 mRNA 与细胞内的小 RNA 互补配对时，mRNA 会被降解，导致基因表达量降低或无法表达。

（三）拷贝数与整合位点

外源基因在禾谷类作物基因组中的拷贝数和整合位点对其表达有显著影响。高拷贝数的外源基因可能会引起基因沉默，而整合到转录活跃区域的外源基因通常比整合到沉默区域的基因表达效率更高。

五、外源基因导入与表达在禾谷类作物改良中的应用

（一）提高作物产量

通过导入与光合作用、养分吸收和利用等相关的外源基因，可以提高禾谷类作物的产量。例如，将编码高效光合作用相关酶的基因导入水稻中，增强水稻的光合效率，从而增加产量。

（二）增强抗逆性

抗病虫害

导入抗虫基因（如 Bt 基因）或抗病基因，可以使禾谷类作物对害虫和病原菌具有更强的抵抗力。例如，转 Bt 基因的玉米能够有效抵抗玉米螟的侵害。

抗非生物胁迫

引入抗逆相关基因，如抗干旱、抗盐碱基因等。如将来自于某些耐盐植物的基因导入小麦中，提高小麦的耐盐性，使其能够在盐碱地等恶劣环境下生长。

（三）改善作物品质

营养品质

可以通过导入编码特定营养成分（如维生素、矿物质、必需氨基酸等）合成相关的基因，改善禾谷类作物的营养品质。例如，通过基因工程提高水稻中维生素 A 前体的含量，有助于缓解维生素 A 缺乏问题。

加工品质

改变禾谷类作物的淀粉、蛋白质等成分的结构和性质，以满足不同的加工需求。如改变小麦面筋蛋白的组成，提高面粉的加工品质。

六、研究进展与挑战

（一）研究进展

近年来，禾谷类作物外源基因导入与表达研究取得了显著成果。在转化方法上，农杆菌介导法和基因枪法不断优化，转化效率有所提高，并且新的转化方法也在不断探索。在基因表达调控方面，对启动子的研究更加深入，能够更精准地控制外源基因的表达。同时，通过多基因转化等技术，实现了对禾谷类作物多个性状的同时改良。

（二）挑战

尽管取得了进展，但仍面临一些挑战。首先，基因沉默问题仍然是影响外源基因稳定表达的重要因素，需要进一步深入研究其机制并寻找有效的解决方法。其次，对于外源基因导入可能带来的环境和食品安全问题需要进行更全面的评估。此外，提高转化效率、降低成本以及拓展可转化的禾谷类作物品种范围等也是未来研究需要解决的问题。

七、结论与展望

禾谷类作物外源基因导入与表达研究为作物改良提供了强大的工具和广阔的前景。通过不断优化导入方法、深入研究基因表达调控机制以及解决相关的挑战，可以更有效地利用基因工程技术提高禾谷类作物的产量、品质和抗逆性。未来的研究需要跨学科的合作，综合考虑科学、环境和社会等多方面因素，以实现禾谷类作物基因工程改良的可持续发展，为保障全球粮食安全做出更大的贡献。同时，随着技术的不断发展，如基因编辑技术的兴起，有望与外源基因导入技术相结合，开创禾谷类作物改良的新局面。