截短型 HBsAg 中蛋白反式激活基因克隆

一、引言

乙肝病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题，严重威胁人类健康。HBsAg（乙肝表面抗原）在 HBV 生命周期和致病过程中发挥着复杂而关键的作用。其中，截短型 HBsAg 中蛋白具有更好的生物学功能，尤其是其潜在的反式激活特性，可能参与调控宿主细胞内众多基因的表达，进而影响病毒的复制、宿主的免疫应答以及疾病的进展。然而，目前对于截短型 HBsAg 中蛋白反式激活的具体靶基因尚未完整明确。因此，开展截短型 HBsAg 中蛋白反式激活基因克隆的研究，对于深入剖析 HBV 致病机制具有至关重要的意义，有望为乙肝的诊断和治疗带来新的突破。

二、材料与方法

（一）材料

细胞系与菌株

选择合适的肝细胞系，如 HepG2 细胞，其具有乙肝病毒感染相关的生理特性，能够较好地模拟体内环境。同时，准备用于基因克隆的大肠杆菌菌株，如 DH5α，用于后续的质粒扩增和保存。

试剂与仪器

高质量的反转录试剂盒、DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等分子生物学试剂。此外，配备核酸电泳仪、PCR 仪、基因测序仪、荧光显微镜等先进仪器设备。

（二）方法

截短型 HBsAg 中蛋白表达载体的构建

截短型 HBsAg 中蛋白基因片段的获取：通过基因合成或从 HBV 感染的临床样本中扩增截短型 HBsAg 中蛋白基因片段。设计特异性引物，利用 PCR 技术从提取的 HBV DNA 中扩增目的基因片段。PCR 反应条件经过优化，包括合适的退火温度、延伸时间等，以确保扩增产物的特异性和产量。

载体选择与处理：选择合适的真核表达载体，如 pcDNA3.1。使用特定的限制性内切酶对载体进行双酶切，使其线性化。酶切反应体系严格按照酶的说明书进行配制，确保酶切完整。

基因片段与载体的连接：将扩增得到的截短型 HBsAg 中蛋白基因片段与线性化的载体通过 T4 DNA 连接酶在合适的温度和缓冲体系下进行连接，构建重组表达载体。连接产物通过转化大肠杆菌 DH5α，在含有相应抗生素的 LB 平板上筛选阳性克隆。挑取单克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证，确保重组载体构建正确。

细胞转染与筛选

细胞培养与转染准备：将 HepG2 细胞培养在含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养基中，在 37℃、5% CO₂的培养箱中培养至合适的细胞密度。转染前一天，将细胞接种于 6 孔板或其他合适的培养器皿中，使转染时细胞达到 70 - 80% 汇合度。

转染方法：采用脂质体转染法或电转染法将构建好的截短型 HBsAg 中蛋白表达载体转染入 HepG2 细胞。对于脂质体转染，将重组质粒与脂质体按照一定比例混合，在无血清培养基中孵育形成复合物后，加入到细胞培养孔中。电转染则需优化电转参数，如电压、脉冲时间等，以提高转染效率同时保证细胞存活率。

稳定转染细胞株的筛选：转染后 48 - 72 小时，加入含有合适筛选药物（如 G418）的培养基进行筛选。定期更换筛选培养基，直至出现稳定生长的细胞克隆。挑取单克隆扩大培养，通过 Western blotting 或免疫荧光等方法检测截短型 HBsAg 中蛋白的表达情况，确保获得稳定表达截短型 HBsAg 中蛋白的细胞株。

基因表达谱分析

总 RNA 提取：收集稳定表达截短型 HBsAg 中蛋白的 HepG2 细胞和对照细胞（转染空载体的细胞），使用 TRIzol 试剂或其他高效的 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。提取过程中注意避免 RNA 酶污染，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪检测 RNA 的完整性和浓度。

RNA 测序或基因芯片分析：采用 RNA 测序技术或基因芯片技术对两组细胞的基因表达谱进行分析。对于 RNA 测序，构建 cDNA 文库，使用高通量测序平台进行测序。对于基因芯片，将标记后的 RNA 与芯片进行杂交，通过扫描芯片获取基因表达数据。

差异表达基因筛选：对获得的基因表达数据进行生物信息学分析，通过合适的统计学方法筛选出在截短型 HBsAg 中蛋白表达细胞中差异表达的基因。设定合理的阈值，如倍数变化大于 2 倍且具有统计学意义（P < 0.05）的基因作为差异表达基因。

反式激活基因的克隆

候选基因的确定：根据基因表达谱分析结果，从差异表达基因中筛选出可能受截短型 HBsAg 中蛋白反式激活的候选基因。这些候选基因可能涉及细胞信号转导、免疫调节、细胞周期调控等与 HBV 致病相关的生物学过程。

基因克隆策略：对于候选基因，设计特异性引物，通过 PCR 技术从基因组 DNA 或 cDNA 中扩增目的基因片段。对于基因组 DNA 扩增，需考虑基因的内含子结构，确保扩增出完整的基因编码序列。对于 cDNA 扩增，则可直接从总 RNA 反转录得到的 cDNA 中进行。扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化后，连接到合适的克隆载体（如 pMD18 - T 载体）上。连接产物转化大肠杆菌 DH5α，通过蓝白斑筛选或菌落 PCR 筛选阳性克隆。挑取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证，确保成功克隆候选基因。

三、结果

截短型 HBsAg 中蛋白表达载体构建成功

经过酶切鉴定和测序验证，成功构建了含有截短型 HBsAg 中蛋白基因的真核表达载体，其序列与预期一致，为后续的细胞转染和功能研究奠定了基础。

稳定表达截短型 HBsAg 中蛋白的细胞株建立

通过筛选，获得了稳定表达截短型 HBsAg 中蛋白的 HepG2 细胞株。Western blotting 和免疫荧光结果显示，截短型 HBsAg 中蛋白在细胞中正确表达，且表达水平稳定。

基因表达谱分析揭示差异表达基因

RNA 测序或基因芯片分析结果显示，在稳定表达截短型 HBsAg 中蛋白的细胞株中，存在大量差异表达基因。这些基因涉及多个生物学过程和信号通路，其中一些与乙肝病毒感染和致病机制密切相关。

反式激活基因克隆成功

通过对差异表达基因的筛选和克隆，成功获得了多个可能受截短型 HBsAg 中蛋白反式激活的基因克隆。这些基因的成功克隆为进一步研究截短型 HBsAg 中蛋白的反式激活机制提供了重要的实验材料。

四、讨论

本研究通过构建截短型 HBsAg 中蛋白表达载体、建立稳定转染细胞株、分析基因表达谱以及克隆反式激活基因等一系列实验，深入探究了截短型 HBsAg 中蛋白的反式激活作用。研究结果表明，截短型 HBsAg 中蛋白能够显著影响宿主细胞的基因表达，这些受调控的基因可能在 HBV 感染和致病过程中发挥重要作用。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，基因表达谱分析可能存在一定的假阳性或假阴性结果，需要进一步通过其他实验方法进行验证。此外，对于克隆得到的反式激活基因，其具体的作用机制和在 HBV 致病过程中的功能仍需深入研究。未来的研究可以进一步利用基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9）对克隆得到的基因进行功能验证，同时深入探究截短型 HBsAg 中蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用，为全面理解 HBV 致病机制和开发新型抗病毒治疗策略提供更坚实的理论基础。

五、结论

综上所述，我们成功完成了截短型 HBsAg 中蛋白反式激活基因克隆的研究。通过本研究，为深入理解 HBV 致病机制开辟了新的途径，为乙肝的诊断和治疗提供了潜在的新靶点和理论依据，有望推动乙肝防治领域的进一步发展。同时，本研究也为后续相关研究提供了重要的实验方法和技术参考。