外源ACO基因调控番茄成熟的基因层面研究

一、引言

番茄（Solanum lycopersicum）作为世界上广泛种植和消费的重要蔬菜作物之一，其成熟过程是一个复杂且受到严格调控的生理过程。果实的成熟不仅影响其外观、口感和风味，还对其营养价值和市场价值有着至关重要的作用。乙烯作为一种关键的植物激素，在番茄成熟过程中扮演着核心角色，它启动和调控了一系列与成熟相关的生理生化变化。

1 - 氨基环丙烷 - 1 - 羧酸氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途径中的关键限速酶，其活性直接影响乙烯的生成量。在番茄中，内源 ACO 基因在果实成熟过程中的表达变化已被广泛研究，但外源 ACO 基因导入番茄后如何在基因层面调控番茄成熟仍存在许多未知。通过将外源 ACO 基因引入番茄基因组，我们可以深入探究其对番茄成熟相关基因表达的影响，进而揭示新的成熟调控机制，这对于番茄品质改良和采后处理等方面具有重要意义。

二、材料与方法

（一）植物材料

选用商业品种的番茄种子，经消毒处理后，在温室中培养至幼苗阶段。选取生长状态一致、健康的幼苗用于后续的遗传转化实验。

（二）外源 ACO 基因的获取

基因克隆

从含有目标 ACO 基因的供体生物（如其他植物物种或微生物）中提取总基因组 DNA。根据已公布的 ACO 基因序列设计特异性引物，通过聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的基因片段。PCR 反应体系包括模板 DNA、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等，反应条件经过优化，包括变性温度、退火温度和延伸时间等参数，以确保获得高质量的目的基因片段。

基因序列分析

对克隆得到的外源 ACO 基因片段进行测序分析，将测序结果与已知的 ACO 基因序列进行比对，确认其序列的准确性和完整性。同时，利用生物信息学工具分析该基因的编码区、启动子区域、可能的转录因子结合位点等信息，为后续研究提供理论依据。

（三）植物表达载体的构建

载体选择

选择适合番茄遗传转化的双元载体，如 pBI121 等，该载体含有 CaMV 35S 启动子等元件，能够在植物细胞中高效表达外源基因。

基因连接与转化

将经过酶切和纯化处理的外源 ACO 基因片段与同样经过酶切处理的植物表达载体进行连接。连接反应使用 T4 DNA 连接酶，在合适的缓冲液和温度条件下进行。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞（如 DH5α）中，通过含有相应抗生素（如卡那霉素）的 LB 平板筛选阳性克隆。对阳性克隆进行质粒提取和酶切验证，确保外源 ACO 基因正确插入到植物表达载体中。

（四）番茄的遗传转化

农杆菌介导的转化

将含有外源 ACO 基因植物表达载体的农杆菌菌株（如 LBA4404）培养至对数生长期，收集菌体，用侵染缓冲液重悬。将番茄幼苗的子叶或下胚轴切段作为外植体，浸泡在农杆菌菌液中进行侵染。侵染后的外植体在共培养培养基上培养一段时间（如 2 - 3 天），然后转移至含有筛选抗生素（如卡那霉素）和抑菌剂（如头孢霉素）的选择培养基上进行筛选培养。定期更换培养基，直至再生出抗性芽。

抗性植株的筛选与鉴定

将在选择培养基上生长的抗性芽转移至生根培养基中，使其生根形成完整植株。对再生植株进行 PCR 检测，使用针对外源 ACO 基因的特异性引物，以确定外源基因是否成功整合到番茄基因组中。同时，通过 Southern blotting 杂交进一步验证外源基因的整合情况，包括整合的拷贝数等信息。

（五）基因表达分析

RNA 提取与 cDNA 合成

在番茄果实不同发育阶段（绿熟期、转色期、成熟期等），分别从转基因番茄和野生型番茄中提取总 RNA。使用 TRIzol 试剂或其他适合的 RNA 提取方法，确保提取的 RNA 纯度高、完整性好。然后，利用反转录酶将提取的 RNA 反转录为 cDNA，用于后续的基因表达分析。

实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）分析

根据番茄成熟相关基因（包括乙烯合成途径基因如 ACS、乙烯信号转导基因如 ETR、果实软化相关基因如 PG 等）和外源 ACO 基因的序列设计特异性引物。以 cDNA 为模板，使用 SYBR Green 或 TaqMan 荧光定量 PCR 试剂进行 qRT - PCR 分析。通过比较转基因番茄和野生型番茄中各基因的相对表达量，分析外源 ACO 基因对成熟相关基因表达的影响。每个样本设置 3 个重复，采用 2 - ΔΔCT 方法计算基因的相对表达量。

基因芯片分析（可选）

为了更全面地了解外源 ACO 基因导入后番茄基因表达的变化情况，可以采用基因芯片技术。提取转基因番茄和野生型番茄果实的 RNA，标记后与番茄全基因组芯片进行杂交。通过对芯片数据的分析，鉴定出差异表达的基因，并进行功能注释和通路分析，进一步揭示外源 ACO 基因在番茄成熟过程中的调控网络。

（六）生理指标测定

乙烯释放量测定

在番茄果实发育过程中，定期采集转基因番茄和野生型番茄果实，将果实置于密封容器中，在一定温度下（如 25℃）放置一段时间（如 1 - 2 小时）。然后，使用气相色谱仪测定容器内乙烯的浓度，根据果实重量和放置时间计算乙烯释放量，以评估外源 ACO 基因对乙烯合成的影响。

果实硬度测定

使用果实硬度计在番茄果实不同部位测量果实硬度。在果实发育的各个阶段，对转基因番茄和野生型番茄进行硬度测定，分析外源 ACO 基因对果实软化过程的影响。

果实色泽和成分分析

通过色差计测量番茄果实的色泽参数（如 L*、a*、b * 值），评估果实的外观变化。同时，采用高效液相色谱（HPLC）等方法分析果实中的糖、酸、维生素 C 等成分含量，以全面了解外源 ACO 基因对番茄果实品质的影响。

三、结果

（一）外源 ACO 基因的克隆与序列分析

成功从供体生物中克隆出外源 ACO 基因片段，测序结果表明其与已知的 ACO 基因序列具有高度同源性。生物信息学分析显示该基因具有典型的 ACO 基因结构特征，包括保守的氨基酸序列和可能的活性位点。

（二）植物表达载体的构建与验证

构建的植物表达载体经酶切验证和测序分析，证实外源 ACO 基因已正确插入到载体中，并且载体上的其他元件（如启动子、终止子等）完整无损，为后续的遗传转化提供了合适的载体。

（三）番茄的遗传转化与鉴定

通过农杆菌介导的遗传转化，获得了一批具有卡那霉素抗性的番茄再生植株。PCR 和 Southern blotting 结果表明，外源 ACO 基因已成功整合到部分番茄植株的基因组中，且不同植株中外源基因的整合拷贝数存在差异。

（四）基因表达分析结果

qRT - PCR 分析

在转基因番茄果实中，外源 ACO 基因在果实发育过程中呈现出特定的表达模式。与野生型番茄相比，转基因番茄中乙烯合成途径基因 ACS 的表达在转色期和成熟期显著上调，表明外源 ACO 基因的导入增强了乙烯合成的上游调控。同时，乙烯信号转导基因 ETR 的表达也发生了变化，在成熟期表达量增加，暗示乙烯信号转导受到影响。果实软化相关基因 PG 在转基因番茄中的表达提前且表达量增加，说明外源 ACO 基因加速了果实软化进程。

基因芯片分析（若进行）

基因芯片分析结果显示，除了上述已知的成熟相关基因外，还有大量其他基因的表达在转基因番茄和野生型番茄之间存在差异。这些差异表达基因涉及到多个生物学过程，包括碳水化合物代谢、细胞壁合成与降解、色素合成等，进一步表明外源 ACO 基因对番茄成熟过程的广泛影响。

（五）生理指标测定结果

乙烯释放量

在果实发育过程中，转基因番茄的乙烯释放量明显高于野生型番茄，尤其是在转色期和成熟期。这与基因表达分析中乙烯合成途径基因表达上调的结果相吻合，表明外源 ACO 基因促进了乙烯的合成。

果实硬度

随着果实发育，转基因番茄果实硬度下降速度比野生型番茄快。在成熟期，转基因番茄果实硬度显著低于野生型番茄，这与 PG 等果实软化相关基因表达变化一致，说明外源 ACO 基因加速了果实软化。

果实色泽和成分

转基因番茄果实色泽变化比野生型番茄提前，表现为 a * 值（红色度）增加更快。在果实成分方面，转基因番茄果实中的可溶性糖含量在成熟期略有增加，而有机酸含量略有下降，维生素 C 含量变化不明显，总体上改变了果实的风味品质。

四、讨论

（一）外源 ACO 基因对乙烯合成途径的影响

外源 ACO 基因的导入增强了番茄果实中乙烯的合成，这主要通过上调乙烯合成途径中的关键基因 ACS 的表达来实现。ACO 作为乙烯合成的下游关键酶，其过量表达可能反馈调节了上游 ACS 基因的表达，从而增加了乙烯的合成量。这种乙烯合成的增加启动了一系列与成熟相关的生理变化，如果实软化和色泽变化。

（二）对乙烯信号转导和成熟相关基因网络的影响

外源 ACO 基因不仅影响了乙烯合成，还对乙烯信号转导产生了影响。ETR 基因表达的变化表明乙烯信号感知和传导过程发生了改变。同时，果实软化相关基因 PG 等的表达变化说明外源 ACO 基因通过乙烯信号转导途径影响了果实软化等成熟相关过程。基因芯片分析结果进一步揭示了外源 ACO 基因在番茄成熟过程中的复杂调控网络，涉及多个与果实品质相关的生物学过程。

（三）对番茄果实品质的影响

从生理指标测定结果来看，外源 ACO 基因对番茄果实品质有着显著影响。果实硬度下降和色泽变化影响了果实的外观和口感，而果实成分的变化则改变了果实的风味。这些结果表明，通过调控外源 ACO 基因的表达，可以在一定程度上对番茄果实品质进行改良，但需要进一步优化以平衡不同品质性状之间的关系。

五、结论

本研究成功将外源 ACO 基因导入番茄基因组，并系统地研究了其在基因层面上对番茄成熟的调控机制。结果表明，外源 ACO 基因通过影响乙烯合成途径、乙烯信号转导和多个成熟相关基因的表达，改变了番茄的成熟进程和果实品质。本研究为进一步理解番茄成熟的分子机制提供了新的视角，同时也为利用基因工程技术改良番茄品质提供了理论和实践依据。未来的研究可以进一步探索外源 ACO 基因与其他成熟调控基因之间的相互作用，以及在不同环境条件下的调控效果，以实现更精准的番茄品质改良。