电激法在植物基因工程的实验室与田野应用

一、引言

随着现代生物技术的飞速发展，植物基因工程已成为改良植物品种、提高农作物产量和品质的关键技术。在众多的基因转移方法中，电激法以其更好的优势受到了广泛关注。电激法是利用短暂的高压电脉冲作用于植物细胞，使细胞膜的通透性暂时增加，从而促进外源基因进入细胞的一种物理方法。在实验室环境下，它为基因功能研究和基因转化机制探索提供了有力手段；在田间应用中，电激法有望突破传统育种的局限，为农业生产带来新的变革。无论是对于基础研究还是实际应用，深入了解电激法在植物基因工程中的应用都具有极其重要的意义。

二、电激法的原理

（一）细胞膜通透性改变

植物细胞膜通常对大分子物质具有屏障作用。当施加电脉冲时，细胞膜在电场作用下发生极化，形成跨膜电位差。当电位差达到一定阈值时，细胞膜上会形成一些短暂的小孔，即电穿孔。这些电穿孔允许外源 DNA、RNA 或其他大分子物质通过细胞膜进入细胞内部，从而实现基因的导入。

（二）细胞内外离子浓度变化

电脉冲还会引起细胞内外离子浓度的剧烈变化。这种离子浓度变化可能会影响细胞内的一些生理生化过程，如激活某些信号通路，有助于细胞对外源基因的摄取和整合。此外，离子浓度的改变可能会影响细胞膜的修复机制，使电穿孔在一定时间内保持开放，增加基因导入的机会。

三、实验室中的电激法应用

（一）实验材料准备

植物材料

选择合适的植物组织或细胞作为受体。常见的有原生质体、悬浮培养细胞、愈伤组织等。对于原生质体的制备，通常采用酶解法，例如，从叶片组织中分离原生质体时，使用纤维素酶和果胶酶混合液在特定的渗透压条件下处理叶片，使细胞壁降解，释放出原生质体。在选择植物材料时，要考虑植物的种类、生长状态以及目标基因的表达特性。

缓冲液和外源基因

制备合适的电激缓冲液，其成分通常包括甘露醇、氯化钙、HEPES 等，以维持合适的渗透压和离子强度，保护细胞在电激过程中的活性。同时，准备好要导入的外源基因，一般是构建在合适的载体上，如质粒载体，载体上含有目的基因、启动子、终止子等必要的调控元件。

（二）电激参数设置

电场强度

电场强度是影响电激效果的关键参数之一。不同的植物材料对电场强度的耐受性不同。一般来说，电场强度范围在 200 - 2000V/cm。对于较为敏感的原生质体，较低的电场强度（如 200 - 500V/cm）可能更合适，以避免细胞过度损伤；而对于一些细胞壁较厚的细胞或组织，可能需要较高的电场强度。

脉冲持续时间和脉冲次数

脉冲持续时间通常在几微秒到几十毫秒之间，如 5 - 50μs。脉冲次数一般为 1 - 10 次。较短的脉冲持续时间和较少的脉冲次数可能不足以形成足够的电穿孔，导致基因导入效率低下；但过长的脉冲持续时间或过多的脉冲次数会严重损伤细胞，降低细胞的存活率和后续的基因表达水平。需要通过大量的预实验来优化这些参数。

（三）电激操作过程

细胞预处理

将准备好的植物细胞或组织悬浮在电激缓冲液中，使细胞充分分散。对于原生质体，可在电激前将其置于冰上预冷一段时间，有助于提高细胞对电激的耐受性。

电激处理

将含有细胞和外源基因的电激缓冲液置于特制的电激杯中，电激杯两端连接电激仪。根据预设的电场强度、脉冲持续时间和脉冲次数进行电激处理。在电激过程中，要确保电激仪的电极与电激杯良好接触，避免产生电弧等异常情况。

后处理

电激完成后，将细胞在电激缓冲液中静置一段时间，一般为 10 - 30 分钟，让细胞膜有时间修复。然后，将细胞转移至合适的培养基中进行培养。对于原生质体，培养基中需要添加合适的植物生长调节剂和营养物质，以促进细胞壁再生和细胞分裂。对于悬浮培养细胞或愈伤组织，培养基的选择要根据细胞的生长需求和目标基因表达的要求来确定。

（四）基因表达检测与分析

分子生物学检测方法

在培养一定时间后（如 24 - 72 小时），可采用多种分子生物学方法检测目的基因是否成功导入并表达。常用的方法包括聚合酶链式反应（PCR），通过设计特异性引物扩增目的基因片段，判断目的基因是否存在于细胞基因组中；逆转录 - 聚合酶链式反应（RT - PCR），用于检测目的基因的转录水平；以及 Western blotting，检测目的基因编码蛋白的表达情况。

表型观察

除了分子生物学检测，还需要观察细胞或组织在基因导入后的表型变化。例如，如果导入的是与色素合成相关的基因，观察细胞颜色的变化；如果是与抗逆性相关的基因，可通过模拟逆境条件（如高盐、干旱等）来观察细胞或组织的耐受性变化。

四、田野中的电激法应用

（一）大田植物材料处理

植株选择与准备

在田间应用电激法时，选择生长健壮、无病虫害的植株。对于一些多年生植物，要选择合适的生长阶段，如在萌芽期或幼苗期进行电激处理可能更有利于基因导入和后续的生长发育。在处理前，对植株进行适当的修剪，去除多余的枝叶，以便于电激操作和减少对电场的干扰。

电极布置

根据植株的大小和形状，设计合理的电极布置方案。对于小型植株，可以使用特制的夹式电极，将电极夹在植株的茎或叶柄等部位；对于大型植株，可能需要采用多点电极插入土壤或缠绕在植株主干等方式，以确保电场能够覆盖目标组织。

（二）田间电激参数调整

考虑环境因素的参数优化

田间环境比实验室复杂得多，需要考虑土壤湿度、温度、空气湿度等环境因素对电激效果的影响。例如，在潮湿的土壤环境下，可能需要适当降低电场强度，以避免电流泄漏和短路现象。在高温环境下，要注意缩短电激处理时间，防止植株过度受热损伤。一般来说，田间电激的电场强度可能会比实验室中稍低，范围在 100 - 1500V/cm，脉冲持续时间和脉冲次数也需要根据实际情况进行调整。

针对不同作物的参数调整

不同的农作物对电激的反应也不同。例如，对于草本植物和木本植物，由于其组织结构和生理特性的差异，电激参数有很大区别。草本植物的细胞壁相对较薄，细胞含水量较高，可能对电激更敏感，电激参数应相对温和；而木本植物的木质部等结构可能会影响电场分布，需要更高的电场强度或特殊的电极设计来确保基因能够有效地导入到目标细胞中。

（三）田间电激后的管理与监测

植株护理

电激处理后，对植株进行精心护理。及时浇水，保持土壤适度湿润，促进植株恢复。同时，根据需要施加适量的肥料，为植株生长提供充足的营养。对于受到电激损伤的部分，如出现局部枯萎或变色的枝叶，要及时修剪，以减少对植株整体生长的影响。

基因表达监测与表型观察

在整个生长季节，持续监测导入基因在植株中的表达情况。可以定期采集叶片、花朵、果实等组织进行分子生物学检测，如上述提到的 PCR、RT - PCR 和 Western blotting 等。同时，密切观察植株的表型变化，包括生长速度、植株形态、抗病虫害能力、产量和品质等方面的变化。例如，如果导入的是抗虫基因，观察植株在田间自然虫害情况下的受损程度；如果是提高果实品质的基因，分析果实的大小、颜色、口感等指标的变化。

五、电激法的优势

（一）广泛的适用性

电激法可用于多种植物，包括单子叶植物和双子叶植物。无论是草本植物还是木本植物，都有成功应用电激法进行基因转化的报道。这种广泛的适用性使得电激法在植物基因工程领域具有很大的优势，尤其是对于一些难以通过传统基因转化方法处理的植物种类。

（二）操作相对简单

与一些依赖复杂生物试剂或微生物载体的基因转化方法相比，电激法的操作相对简单。它主要依靠电激仪和基本的缓冲液等设备和试剂，不需要复杂的病毒载体构建或农杆菌介导转化所需的特殊菌株培养等步骤。这使得在实验室和田间条件下都能相对容易地开展基因转化实验。

（三）可重复性高

在优化了电激参数后，电激法的可重复性较高。只要保持相同的植物材料、电激条件和后续培养环境，就能得到较为稳定的基因转化结果。这种可重复性对于科学研究和农业生产中的基因工程应用都非常重要，有助于保证实验结果的准确性和可靠性。

六、电激法面临的挑战

（一）细胞损伤问题

尽管电激法可以通过调整参数来减少细胞损伤，但在实际操作中，仍难以完整避免。过高的电场强度、过长的脉冲持续时间或过多的脉冲次数都会导致细胞死亡或活力下降。这不仅会降低基因转化效率，还可能影响植株的正常生长发育。因此，如何在保证基因导入的同时最大限度地减少细胞损伤是电激法面临的一个重要挑战。

（二）基因整合效率低

外源基因成功导入细胞后，其在植物基因组中的整合效率仍然较低。部分外源基因可能只是暂时存在于细胞内，不能稳定整合到基因组中，导致基因表达不稳定或在后续的细胞分裂过程中丢失。提高基因整合效率需要进一步深入研究植物细胞的基因组结构和基因整合机制，以及探索新的电激参数组合或辅助处理方法。

（三）田间应用的复杂性

田间环境的复杂性给电激法的应用带来了诸多困难。除了前面提到的环境因素对电激参数的影响外，还存在诸如大规模电极布置成本高、电激过程中的安全隐患（如触电风险）以及难以精确控制每个植株的电激效果等问题。这些问题限制了电激法在田间大规模应用的推广速度。

七、电激法与其他植物基因工程技术的结合

（一）与农杆菌介导转化法结合

农杆菌介导转化法是一种常用的植物基因工程技术。将电激法与农杆菌介导转化法结合，可以发挥各自的优势。例如，在农杆菌侵染植物组织后，通过电激处理，可以促进农杆菌向植物细胞内转移 T - DNA 的效率，同时也可能增强植物细胞对 T - DNA 的摄取和整合能力。这种结合方法可以在一定程度上提高基因转化效率，扩大可转化植物的范围。

（二）与基因枪轰击法结合

基因枪轰击法是利用高速微弹将外源基因导入植物细胞的方法。电激法与基因枪轰击法结合时，电激处理可以在基因枪轰击后对细胞进行处理，帮助修复细胞因微弹轰击造成的损伤，同时促进外源基因的整合。这种联合应用方式可以综合两种方法的优点，提高基因导入和整合的效果。

八、结论

电激法作为一种重要的植物基因工程技术，在实验室和田野中都有着广泛的应用前景。通过深入研究电激法的原理和优化操作参数，可以在一定程度上克服其面临的挑战，提高基因转化效率和稳定性。同时，与其他植物基因工程技术的结合为其进一步发展提供了新的思路。在未来的植物基因工程研究和农业生产实践中，电激法有望为培育优良植物品种、提高农作物产量和品质发挥更加重要的作用。然而，我们也需要继续探索和创新，以更好地适应复杂的实际应用环境和满足不断增长的农业发展需求。