大鼠骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白转染实验

一、引言

骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为一种具有多向分化潜能和自我更新能力的成体干细胞，在组织工程、再生医学和细胞治疗等领域展现出巨大的应用前景。大鼠是常用的实验动物模型，其 BMSCs 的研究对于人类相关疾病和治疗策略的探索具有重要的参考价值。绿色荧光蛋白（GFP）作为一种广泛应用的报告基因，能够在不影响细胞生理功能的情况下，实现对转染细胞的可视化追踪。因此，成功将 GFP 基因转染至大鼠 BMSCs 对于深入研究 BMSCs 在体内的分布、迁移、分化等生物学过程至关重要。然而，BMSCs 具有更好的细胞特性，其转染过程面临着诸多挑战，如转染效率低、细胞毒性等问题。本研究旨在探索优化的大鼠 BMSCs GFP 转染方案，为相关领域的研究奠定坚实的实验基础。

二、材料与方法

（一）实验动物

选取健康的成年 SD 大鼠（体重 200 - 250g），雌雄不限。所有大鼠均饲养于标准的动物实验环境中，保持适宜的温度、湿度和光照周期，自由饮水和进食。

（二）大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

骨髓采集

通过颈椎脱臼法处死大鼠，在无菌条件下分离股骨和胫骨。用含有肝素（100 U/mL）的 PBS 冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液。

细胞分离与培养

将骨髓细胞悬液缓慢加入到密度为 1.073 g/mL 的淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心（2000 rpm，20 分钟）。吸取中间的单个核细胞层，用 PBS 洗涤两次（1000 rpm，5 分钟）。然后，将细胞重悬于含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 链霉素的低糖 DMEM 培养基中，接种于培养瓶中，置于 37℃、5% CO₂的培养箱中培养。24 小时后第一次换液，去除未贴壁的细胞，以后每 3 - 4 天更换一次培养基。

（三）绿色荧光蛋白转染实验

转染试剂及载体

选用了两种常见的转染试剂，脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 和聚乙烯亚胺（PEI），以及携带绿色荧光蛋白基因（GFP）的质粒载体。质粒载体在使用前需进行大量提取和纯化，确保其质量和纯度符合转染要求。

转染前细胞准备

当 BMSCs 生长至 70 - 80% 汇合度时，进行转染。在转染前一天，将细胞接种于 6 孔板或 24 孔板中，每孔细胞数量根据板的规格进行调整，以保证转染时细胞密度适宜。同时，更换新鲜的培养基，确保细胞处于良好的生长状态。

脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 转染方法

按照脂质体转染试剂的说明书进行操作。首先，将适量的质粒 DNA（根据不同的实验条件设置不同的量，范围从 0.5 - 2μg）稀释于无血清的 Opti - MEM 培养基中，轻轻混匀。然后，将 Lipofectamine 2000 试剂在另一管 Opti - MEM 培养基中稀释，室温孵育 5 分钟。之后，将稀释后的 DNA 溶液与 Lipofectamine 2000 溶液轻轻混合，室温孵育 20 分钟，形成转染复合物。最后，将转染复合物逐滴加入到含有细胞的孔中，轻轻晃动培养板，使复合物均匀分布。将培养板置于 37℃、5% CO₂的培养箱中继续培养。

聚乙烯亚胺（PEI）转染方法

对于 PEI 转染，将 PEI 与质粒 DNA 按照不同的质量比（N/P 比，范围从 5 - 20）进行混合。先将质粒 DNA 稀释于适量的 PBS 中，然后将 PEI 溶液缓慢加入到 DNA 溶液中，轻轻混匀，室温孵育 15 - 30 分钟，形成转染复合物。将复合物加入到细胞培养孔中，操作过程与脂质体转染类似。转染后的细胞同样置于 37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

（四）转染效率及细胞活性检测

荧光显微镜观察

在转染后 24、48 和 72 小时，使用荧光显微镜观察细胞的 GFP 表达情况。随机选取多个视野，计算每个视野中 GFP 阳性细胞的比例，以此评估转染效率。同时，观察细胞的形态和生长状态，初步判断转染对细胞的影响。

流式细胞术分析

收集转染后的细胞，用胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液。通过流式细胞仪检测 GFP 阳性细胞的比例，进一步精确评估转染效率。同时，检测细胞的活性指标，如细胞凋亡率等，以评估转染试剂和过程对细胞的毒性作用。

细胞增殖能力检测

采用 CCK - 8 法检测转染后细胞的增殖能力。在转染后的不同时间点（0、24、48、72 小时等），向细胞培养孔中加入 CCK - 8 试剂，按照试剂盒的说明书操作，在酶标仪上测定吸光度值（OD 值）。根据 OD 值绘制细胞增殖曲线，分析转染对细胞增殖的影响。

三、结果

（一）大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

经过密度梯度离心和培养，成功从大鼠骨髓中分离出 BMSCs。原代培养的 BMSCs 在接种 24 小时后开始贴壁，呈梭形或多角形。随着培养时间的延长，细胞逐渐增殖并形成集落。传代培养后，细胞形态保持稳定，生长状态良好。通过流式细胞术对细胞表面标志物进行检测，结果显示培养的 BMSCs 高表达间充质干细胞标志物 CD29、CD44 和 CD90，低表达造血干细胞标志物 CD34 和 CD45，证明所培养的细胞为 BMSCs。

（二）不同转染试剂和条件下的转染效率

脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000

在不同的 DNA 量条件下，转染效率有所不同。当 DNA 量为 1μg 时，转染后 24 小时，荧光显微镜下观察到部分细胞表达 GFP，转染效率约为 20%；48 小时后，转染效率有所提高，达到约 35%；72 小时时，转染效率可达 40% 左右。通过流式细胞术分析结果与荧光显微镜观察基本一致，且在该转染条件下，细胞凋亡率较低，细胞形态和增殖能力在转染后短时间内未受到明显影响。

聚乙烯亚胺（PEI）

不同 N/P 比下，PEI 的转染效率存在差异。当 N/P 比为 10 时，转染后 24 小时转染效率约为 15%，48 小时后提高到约 30%，72 小时可达约 38%。随着 N/P 比的增加，转染效率有一定提高，但细胞凋亡率也相应增加。在 N/P 比为 20 时，虽然转染效率可达到约 45%，但细胞凋亡明显增加，细胞增殖能力受到显著抑制。

（三）细胞活性检测结果

流式细胞术检测细胞凋亡

脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 转染后的细胞凋亡率在转染后 24 小时约为 5%，48 小时约为 8%，72 小时约为 10%。而 PEI 转染的细胞在不同 N/P 比下凋亡率不同，N/P 比为 10 时，24 小时凋亡率约为 8%，48 小时约为 12%，72 小时约为 15%；N/P 比为 20 时，24 小时凋亡率可达约 15%，48 小时约为 20%，72 小时约为 25%。

CCK - 8 法检测细胞增殖

脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 转染后的细胞在转染后 48 小时内增殖能力与未转染细胞相比无明显差异，但在 72 小时时增殖速度略有减慢。PEI 转染的细胞在 N/P 比为 10 时，48 小时后增殖能力开始受到一定影响，而在 N/P 比为 20 时，细胞增殖在转染后 24 小时就明显受到抑制。

四、讨论

（一）大鼠骨髓间充质干细胞培养的优化

在本研究中，通过密度梯度离心法成功从大鼠骨髓中分离出 BMSCs，并在适宜的培养条件下实现了稳定的培养。在细胞培养过程中，培养基的选择、血清浓度以及培养环境等因素对于 BMSCs 的生长和增殖至关重要。低糖 DMEM 培养基和 10% FBS 的组合能够满足 BMSCs 的营养需求，同时减少细胞分化的可能性。此外，第一次换液时间的选择也会影响细胞的纯度和生长状态，本研究在 24 小时后换液有效地去除了未贴壁的血细胞等杂质。

（二）转染试剂和条件对转染效率的影响

脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000

Lipofectamine 2000 作为一种常用的转染试剂，在本研究中表现出较好的转染效率和较低的细胞毒性。其转染效率随着时间的延长而提高，这可能是由于随着时间推移，更多的质粒 DNA 进入细胞核并实现基因表达。合适的 DNA 量对于转染效率和细胞活性的平衡至关重要，本研究中 1μg 的 DNA 量在保证一定转染效率的同时，对细胞的损伤较小。

聚乙烯亚胺（PEI）

PEI 的转染效率与 N/P 比密切相关。在一定范围内，随着 N/P 比的增加，转染效率提高，但同时细胞毒性也增加。这是因为高 N/P 比下，PEI 与 DNA 形成的复合物可能会对细胞产生更大的物理和化学刺激，导致细胞凋亡增加和增殖能力下降。因此，在使用 PEI 转染时，需要综合考虑转染效率和细胞活性，选择合适的 N/P 比。

（三）转染对细胞生物学行为的影响

转染过程不仅影响转染效率，还会对细胞的生物学行为产生影响，如细胞凋亡和增殖。本研究结果表明，不同的转染试剂和条件对细胞凋亡和增殖的影响不同。脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 对细胞的影响相对较小，而 PEI 在高 N/P 比时对细胞的损伤较为明显。这提示我们在进行转染实验时，需要全面评估转染对细胞的影响，以确保转染后的细胞能够保持其生物学功能，满足后续实验的要求。

五、结论

本研究成功建立了大鼠骨髓间充质干细胞的培养体系，并对其进行了绿色荧光蛋白转染实验。通过比较脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 和聚乙烯亚胺（PEI）在不同条件下的转染效率和对细胞活性的影响，发现 Lipofectamine 2000 在较低的 DNA 量下能够获得较好的转染效率且对细胞毒性较小，而 PEI 在合适的 N/P 比下也可实现较高的转染效率，但需要注意其细胞毒性。本研究结果为进一步利用大鼠骨髓间充质干细胞进行细胞追踪、组织工程和再生医学等领域的研究提供了重要的实验依据和技术支持，同时也为优化 BMSCs 转染方案提供了参考。在未来的研究中，可以进一步探索新的转染技术和方法，以提高转染效率和降低细胞毒性，更好地发挥 BMSCs 在生物医学研究中的作用。