农杆菌介导高羊茅遗传转化的新突破进展

一、引言

高羊茅（Festuca arundinacea）作为一种重要的冷季型草坪草和优质牧草，在全球范围内广泛种植。然而，随着环境变化和对其品质要求的不断提高，传统的育种方法在提高高羊茅的抗逆性、品质和产量等方面面临诸多挑战。遗传转化技术为高羊茅的品种改良提供了一种极有潜力的途径，其中农杆菌介导的遗传转化由于其具有插入片段稳定性好、拷贝数低等优点而备受关注。但长期以来，农杆菌介导高羊茅遗传转化一直存在转化效率低、再生困难等问题，限制了其在高羊茅基因工程中的广泛应用。近年来，在该领域取得了一系列新的突破进展，这些进展有望克服现有障碍，为高羊茅的遗传改良带来新的机遇。

二、农杆菌介导高羊茅遗传转化的传统挑战

（一）宿主特异性

农杆菌对高羊茅的侵染能力有限，这主要是由于高羊茅自身的防御机制和生理特性。高羊茅的细胞壁组成和结构可能阻碍农杆菌的附着和 T - DNA 的转移，同时其内部的信号传导途径对农杆菌的识别和响应与其他模式植物存在差异。

（二）再生体系的复杂性

高羊茅的组织培养再生过程较为复杂，受到多种因素的影响。其愈伤组织诱导率低、分化能力差，而且不同基因型之间的再生能力差异显著。这使得在转化后难以获得足够数量的再生植株，从而影响了转化效率的统计和后续研究。

（三）筛选标记的局限性

传统的筛选标记在高羊茅遗传转化中可能存在一些问题。例如，一些抗生素筛选标记可能会对高羊茅的再生和生长产生负面影响，或者在自然环境中存在潜在的生物安全性风险。同时，筛选标记基因的表达可能受到高羊茅自身基因表达调控网络的干扰，导致筛选结果不准确。

三、新突破进展：实验方法与策略

（一）农杆菌菌株和载体的优化

新型农杆菌菌株筛选

通过对多种农杆菌菌株的比较研究，发现了一些对高羊茅具有更高侵染效率的菌株。例如，经过改造的农杆菌菌株 AGL1 - ΔvirG，通过对其 vir 基因调控区的修饰，增强了其对高羊茅的识别和侵染能力。这种菌株能够更好地适应高羊茅的细胞环境，提高 T - DNA 的转移效率。

载体构建的改进

构建了具有更高效启动子和增强子元件的双元载体。在载体设计中，引入了高羊茅内源的强启动子，如与生长发育相关基因的启动子，来驱动目的基因的表达。同时，添加了特定的增强子元件，这些元件能够与启动子协同作用，增强基因表达水平。此外，优化了载体上 T - DNA 边界序列，减少了 T - DNA 在整合过程中的截断和异常整合现象，提高了转化的准确性和稳定性。

（二）预处理提高高羊茅对农杆菌的敏感性

化学预处理

采用化学试剂对高羊茅外植体进行预处理。例如，在侵染前使用乙酰丁香酮（AS）处理高羊茅愈伤组织或幼嫩叶片，AS 能够模拟植物受伤时产生的信号分子，激活农杆菌的 vir 基因表达，从而增强农杆菌的侵染能力。同时，还发现了一些新型的化学诱导剂，如特定的植物激素类似物，它们能够在不影响高羊茅细胞活力的情况下，改变其细胞壁通透性，使农杆菌更容易进入细胞。

物理预处理

探索了物理方法对高羊茅外植体的预处理效果。通过超声处理高羊茅愈伤组织，能够在一定程度上破坏细胞壁结构，增加细胞壁的孔隙度，有利于农杆菌的附着和 T - DNA 的导入。此外，适度的电场处理也被发现可以提高农杆菌与高羊茅细胞的相互作用效率，但需要精确控制电场强度和处理时间，以避免对细胞造成不可逆的损伤。

（三）优化转化条件

共培养条件优化

对农杆菌与高羊茅外植体的共培养条件进行了精细调整。研究发现，共培养温度、时间和培养基成分对转化效率有着至关重要的影响。将共培养温度控制在 22 - 25℃，相较于传统的 28℃，能够显著提高转化效率。这可能是因为较低的温度更有利于高羊茅细胞与农杆菌之间的相互作用和 T - DNA 的整合，同时减少了农杆菌的过度生长对高羊茅细胞的损害。延长共培养时间至 3 - 5 天，并在共培养培养基中添加特定的氨基酸和维生素，为农杆菌和高羊茅细胞提供了更适宜的营养环境，促进了 T - DNA 的转移。

选择合适的外植体类型和发育阶段

比较了不同类型的高羊茅外植体（如种子、幼叶、茎尖、愈伤组织等）在遗传转化中的效果。结果表明，幼嫩的叶片和由幼穗诱导产生的 Ⅱ 型愈伤组织是较为理想的外植体。幼叶细胞具有较高的分裂活性和对农杆菌的耐受性，而 Ⅱ 型愈伤组织具有较好的再生能力和对 T - DNA 的接受能力。同时，选择处于特定发育阶段的外植体也很关键，例如，在叶片展开后 7 - 10 天采集的幼叶，其细胞状态适合农杆菌介导的转化。

（四）新型筛选标记和筛选策略

无抗生素筛选标记系统

开发了基于代谢互补或可视化标记的新型筛选系统。例如，利用高羊茅细胞中某些营养代谢途径的缺陷，构建能够互补这种缺陷的基因作为筛选标记。当外植体成功转化后，含有互补基因的细胞能够在缺乏相应营养物质的培养基上正常生长，从而实现筛选目的。此外，采用可视化标记如荧光蛋白基因（如 GFP、RFP 等），通过荧光显微镜直接观察和筛选转化细胞，这种方法不仅避免了抗生素筛选标记的潜在风险，而且能够更直观、准确地识别转化体。

多轮筛选策略

采用多轮筛选方法提高筛选的准确性。在第一轮筛选中，利用宽松的筛选条件初步筛选出可能的转化体，然后在后续的培养过程中逐步提高筛选压力。例如，在第一轮筛选中使用较低浓度的筛选试剂，让部分转化细胞和非转化细胞都能生长，然后在第二轮筛选中增加筛选试剂浓度，淘汰那些假阳性的非转化细胞。通过这种多轮筛选策略，可以有效减少假阳性结果，提高筛选得到的转化植株的纯度。

四、新突破进展的应用前景

（一）提高高羊茅的抗逆性

通过农杆菌介导的遗传转化，可以将抗逆相关基因导入高羊茅。例如，将抗旱基因（如编码脱水蛋白的基因）、抗盐基因（如 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因）和抗寒基因（如冷诱导蛋白基因）等导入高羊茅，有望培育出具有更强抗逆能力的新品种。这些新品种能够在干旱、盐碱和寒冷等恶劣环境条件下保持较好的生长状态，扩大高羊茅的种植范围，提高其在草坪和牧草生产中的适应性。

（二）改善高羊茅的品质

可以利用遗传转化技术改善高羊茅的品质特性。比如，导入与提高蛋白质含量相关的基因，增加高羊茅作为牧草的营养价值。同时，引入调控叶片质地和色泽的基因，培育出具有更美观、柔软叶片的高羊茅品种，满足高等草坪市场的需求。此外，通过调控植物激素合成相关基因的表达，还可以改善高羊茅的生长习性，如降低其丛生性，使草坪更加平整。

（三）增强高羊茅的病虫害抗性

将抗病虫害基因导入高羊茅，增强其对常见病虫害的抵抗能力。例如，导入抗真菌病害基因（如几丁质酶基因、β - 1,3 - 葡聚糖酶基因等），可以有效抵御炭疽病、白粉病等真菌病害的侵袭。同时，引入抗虫基因（如 Bt 毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因等），减少高羊茅受到蝗虫、蛴螬等害虫的危害，降低农药使用量，实现绿色环保的草坪和牧草生产。

五、讨论与展望

尽管在农杆菌介导高羊茅遗传转化方面取得了新的突破进展，但仍然存在一些问题需要进一步解决。例如，虽然新型筛选标记和筛选策略在一定程度上提高了筛选效率，但对于一些复杂的基因转化，可能仍然存在假阳性或假阴性的问题。此外，转化过程中的一些物理和化学预处理方法可能对高羊茅细胞的基因组稳定性产生潜在影响，需要进一步评估。

在未来的研究中，可以进一步探索更高效、更安全的遗传转化方法。结合基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9）与农杆菌介导的遗传转化，实现对高羊茅基因的精准编辑和改良。同时，深入研究高羊茅的基因表达调控网络，开发更适合高羊茅的启动子和调控元件，提高目的基因的表达水平和稳定性。此外，加强对转化植株的长期监测和评估，确保其在环境中的安全性和稳定性，为高羊茅的遗传改良和可持续利用提供更坚实的技术支持。

六、结论

综上所述，农杆菌介导高羊茅遗传转化的新突破进展为高羊茅的遗传改良带来了新的希望。通过优化农杆菌菌株和载体、预处理方法、转化条件以及筛选策略等方面，显著提高了转化效率和转化植株的质量。这些进展在提高高羊茅抗逆性、品质和病虫害抗性等方面具有广阔的应用前景，尽管仍面临一些挑战，但为未来高羊茅的基因工程研究和品种改良奠定了坚实的基础。