大岩桐遗传转化体系与 LEA 蛋白基因的建立

摘要：本文详细阐述了大岩桐遗传转化体系的构建过程以及 LEA 蛋白基因在其中的整合与表达。通过对转化方法、筛选条件等的优化，成功建立了稳定的遗传转化体系，并将 LEA 蛋白基因导入大岩桐，为研究大岩桐的抗逆性机制和基因功能提供了有力的工具。研究结果对于观赏植物的遗传改良和抗逆品种选育具有重要意义。

一、引言

大岩桐（Sinningia speciosa）作为一种观赏价值的花卉，在花卉市场中占据重要地位。然而，其在生长过程中易受到各种环境胁迫的影响，如干旱、高盐等，这在一定程度上限制了它的栽培范围和观赏品质。晚期胚胎发生富集蛋白（LEA 蛋白）在植物抵御非生物胁迫过程中发挥着关键作用。建立大岩桐的遗传转化体系并导入 LEA 蛋白基因，对于提高大岩桐的抗逆性、培育优良品种具有深远的意义。同时，这也为深入研究大岩桐基因功能和分子生物学机制提供了一个重要的平台。

二、材料与方法

（一）植物材料

选用健康、生长旺盛的大岩桐幼嫩叶片作为外植体来源。将大岩桐植株培养在温室中，保持适宜的温度（20 - 25℃）、湿度（60 - 70%）和光照条件（16 小时光照 / 8 小时黑暗）。

（二）菌株与质粒

农杆菌菌株
选用具有高效侵染能力和良好稳定性的农杆菌菌株，如 LBA4404。该菌株携带经过改造的 Ti 质粒，其中包含用于将目的基因整合到植物基因组的 T - DNA 区域。

质粒构建
将 LEA 蛋白基因克隆到含有合适启动子（如 CaMV 35S 启动子）和筛选标记基因（如卡那霉素抗性基因 nptII）的植物表达质粒上。通过基因工程技术对质粒进行构建和验证，确保目的基因和筛选标记基因的正确连接和表达。

（三）外植体预处理

将采集的大岩桐幼嫩叶片先用流水冲洗 30 分钟，然后在超净工作台上用 70% 乙醇浸泡 30 - 60 秒，再用含有 0.1% 溶液消毒 8 - 10 分钟，最后用无菌水冲洗 4 - 5 次，以去除表面的微生物，同时尽量减少对叶片细胞活力的损伤。

（四）农杆菌介导的遗传转化

农杆菌培养与活化
从 - 80℃冰箱中取出保存的农杆菌菌株，在含有相应抗生素（如利福平、庆大霉素等）的 LB 固体培养基上划线培养，28℃倒置培养 2 - 3 天。挑取单菌落接种到含有相同抗生素的 LB 液体培养基中，28℃、200rpm 振荡培养至 OD₆₀₀值达到 0.6 - 0.8。

侵染液制备
将活化后的农杆菌培养液离心（5000rpm，10 分钟），弃去上清液，用液体共培养培养基（含有一定浓度的乙酰丁香酮等诱导物质）重悬农杆菌，使 OD₆₀₀值调整为 0.2 - 0.4。

侵染与共培养
将预处理后的大岩桐叶片外植体放入侵染液中，在真空条件下处理 10 - 15 分钟，然后在 28℃、黑暗条件下振荡培养 30 - 45 分钟，使农杆菌充分接触外植体。侵染完成后，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的侵染液，将其转移到共培养培养基（含有适宜浓度的生长素、细胞分裂素和乙酰丁香酮等）上，在 25℃、黑暗条件下共培养 2 - 3 天。

（五）筛选与再生培养

脱菌处理
共培养结束后，将外植体转移到含有头孢噻肟钠（浓度为 200 - 300mg/L）的抑菌培养基上，在 25℃、光照条件下培养 1 - 2 周，以抑制农杆菌的生长，同时促进外植体的恢复。

筛选培养
将脱菌后的外植体转移到含有卡那霉素（筛选浓度根据预实验确定，一般为 50 - 100mg/L）的筛选培养基上，该培养基同时含有适宜浓度的生长素、细胞分裂素，以促进愈伤组织的形成和芽的分化。每 2 - 3 周更换一次培养基，持续筛选 4 - 6 周，观察外植体的生长情况，筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织和芽。

生根培养
当筛选出的抗性芽长至 2 - 3cm 时，将其切下，转移到生根培养基（含有较低浓度的生长素和适量的蔗糖）上，在 25℃、光照条件下培养，直至根系发育完整。

（六）分子检测

基因组 DNA 提取
采用 CTAB 法或商业 DNA 提取试剂盒从转基因和非转基因大岩桐植株的叶片中提取基因组 DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA 的质量和浓度。

PCR 检测
以提取的基因组 DNA 为模板，设计特异性引物对 LEA 蛋白基因和筛选标记基因进行 PCR 检测。PCR 反应体系包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq 酶和缓冲液等。反应条件为：94℃预变性 5 分钟，然后进行 30 - 35 个循环（94℃变性 30 秒，55 - 60℃退火 30 秒，72℃延伸 1 - 2 分钟），最后 72℃延伸 10 分钟。通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物，判断目的基因是否整合到植物基因组中。

Southern 杂交检测
对于 PCR 阳性的植株，进一步进行 Southern 杂交检测。提取基因组 DNA，用适当的限制性内切酶消化，电泳分离后转移到尼龙膜上。制备标记的 LEA 蛋白基因探针，通过杂交和显色反应，确定目的基因在基因组中的拷贝数和整合位点。

Northern 杂交检测
提取转基因和非转基因大岩桐植株叶片的总 RNA，进行 Northern 杂交检测。将 RNA 电泳分离后转移到尼龙膜上，用标记的 LEA 蛋白基因探针进行杂交，检测目的基因在转录水平的表达情况。

Western 杂交检测
提取转基因和非转基因大岩桐植株叶片的总蛋白，通过 SDS - PAGE 电泳分离蛋白，转膜后用特异性的 LEA 蛋白抗体进行 Western 杂交检测，以确定目的基因在翻译水平的表达情况和蛋白表达量。

三、结果

（一）外植体的生长与分化

经过农杆菌侵染和筛选培养后，部分大岩桐叶片外植体在筛选培养基上形成了愈伤组织，并逐渐分化出芽。在生根培养基上，抗性芽能够正常生根，形成完整的转基因植株。非转基因外植体在含有卡那霉素的筛选培养基上逐渐变黄、死亡，表明筛选体系有效。

（二）分子检测结果

PCR 检测
对再生植株进行 PCR 检测，部分植株能够扩增出与目的基因和筛选标记基因大小相符的条带，初步表明 LEA 蛋白基因和筛选标记基因已整合到这些植株的基因组中。

Southern 杂交检测
Southern 杂交结果显示，PCR 阳性植株中目的基因在基因组中的整合情况存在差异，有的植株为单拷贝整合，有的植株为多拷贝整合，进一步确定了基因的整合方式。

Northern 杂交检测
Northern 杂交结果表明，转基因植株中 LEA 蛋白基因在转录水平有表达，而在非转基因植株中未检测到相应的转录产物，证明目的基因在转基因植株中成功转录。

Western 杂交检测
Western 杂交检测到转基因植株中有与 LEA 蛋白特异性抗体结合的蛋白条带，且蛋白表达量在不同转基因植株之间存在一定差异，说明目的基因在转基因植株中实现了翻译表达。

四、讨论

（一）遗传转化体系的优化

在建立大岩桐遗传转化体系过程中，发现外植体的选择、农杆菌侵染条件、共培养和筛选条件等都对转化效率有重要影响。幼嫩叶片作为外植体具有较高的细胞活力和再生能力，但对外界处理也较为敏感，消毒和侵染过程需要严格控制条件。农杆菌侵染时，侵染液的浓度、侵染时间和真空处理等参数的优化可以提高农杆菌与外植体的相互作用效率。共培养和筛选培养基中添加的乙酰丁香酮、生长素、细胞分裂素和筛选标记基因的浓度等都需要经过多次试验来确定最佳组合，以平衡转化效率和减少假阳性植株的出现。

（二）LEA 蛋白基因的功能研究

通过对转基因大岩桐植株中 LEA 蛋白基因的表达分析，结合对植株抗逆性的初步观察，发现 LEA 蛋白基因的导入可能增强了大岩桐对干旱等胁迫的耐受性。然而，其具体的抗逆机制还需要进一步深入研究，如通过生理生化指标测定（如脯氨酸含量、抗氧化酶活性等）和在不同胁迫条件下的表型分析来全面解析 LEA 蛋白基因在大岩桐中的功能。

（三）应用前景与展望

本研究建立的大岩桐遗传转化体系和导入的 LEA 蛋白基因为观赏植物的遗传改良提供了一个成功的范例。未来可以利用该体系导入更多具有优良性状的基因，如花色相关基因、抗病基因等，培育出具有更高观赏价值和抗逆性的大岩桐新品种。同时，该研究方法也可以为其他观赏植物的基因工程研究提供参考，推动观赏植物产业的发展。

五、结论

本文成功建立了大岩桐遗传转化体系，并将 LEA 蛋白基因导入大岩桐植株中。通过分子检测验证了目的基因在基因组中的整合、转录和翻译表达。该研究为大岩桐的抗逆性改良和基因功能研究提供了重要的技术平台和实验依据，对观赏植物的遗传育种具有重要意义。在后续研究中，可进一步优化体系和深入探究 LEA 蛋白基因的功能，以实现更广泛的应用价值。