Ag85B 成熟蛋白基因结核病免疫研究新突破

摘要：本文聚焦于 Ag85B 成熟蛋白基因在结核病免疫研究中的新突破。阐述了 Ag85B 蛋白在结核分枝杆菌中的重要地位，详细描述了围绕其成熟蛋白基因开展的一系列实验，包括基因克隆、表达载体构建、免疫动物模型的建立以及免疫效果评价等。研究结果显示了 Ag85B 成熟蛋白基因在结核病免疫预防和治疗方面的巨大潜力，为新型结核病疫苗的研发和免疫治疗策略提供了重要理论依据和实践指导。

一、引言

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病。尽管目前已有卡介苗（BCG）等预防手段，但由于其保护效果有限，尤其是对成人肺结核的保护作用不足，全球结核病疫情依然严峻。因此，寻找更有效的结核病防治策略迫在眉睫。

Ag85B 蛋白是结核分枝杆菌分泌蛋白家族中的重要成员，在结核分枝杆菌的生长、致病以及免疫反应中具有关键作用。Ag85B 蛋白参与细胞壁合成，与结核分枝杆菌在宿主体内的存活和繁殖密切相关。同时，它也是一种强效的免疫原，能够诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应。然而，以往对于 Ag85B 的研究多集中在其全蛋白水平，对于其成熟蛋白基因的研究尚未充分挖掘其潜力。本研究旨在深入探索 Ag85B 成熟蛋白基因在结核病免疫中的作用，以期为结核病的免疫防治带来新的突破。

二、材料与方法

（一）材料

菌株与质粒
结核分枝杆菌标准菌株 H37Rv 用于获取 Ag85B 基因。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 和 BL21（DE3）菌株分别用于基因克隆和蛋白表达。表达载体选用 pET - 28a（+），该载体带有 His - Tag 标签，便于后续蛋白纯化和检测。

实验动物
选用 6 - 8 周龄的 C57BL/6 小鼠，体重约 20 - 22g，购自正规实验动物中心。所有动物实验均在符合伦理规范的条件下进行。

主要试剂
限制性内切酶（如 BamHI、HindIII）、T4 DNA 连接酶、DNA 聚合酶、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、胎牛血清、RPMI - 1640 培养基、弗氏完整佐剂和弗氏不完整佐剂等。

（二）方法

Ag85B 成熟蛋白基因的克隆

结核分枝杆菌基因组 DNA 的提取：将结核分枝杆菌 H37Rv 菌株接种于改良罗氏培养基中，37℃培养至对数生长期。收集细菌，采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的 DNA 质量和浓度。

引物设计：根据 GenBank 中公布的结核分枝杆菌 Ag85B 基因序列，设计特异性引物。引物两端分别引入 BamHI 和 HindIII 限制性内切酶识别位点，以方便后续与表达载体的连接。同时，确保引物扩增的区域为编码 Ag85B 成熟蛋白的基因序列。

PCR 扩增：以提取的结核分枝杆菌基因组 DNA 为模板，加入设计好的引物、dNTPs、DNA 聚合酶等进行 PCR 扩增。反应条件经过优化，包括变性温度、退火温度和延伸时间等。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用胶回收试剂盒回收目的条带。

表达载体的构建与鉴定

载体和目的基因的双酶切：将回收的 PCR 产物和表达载体 pET - 28a（+）分别用 BamHI 和 HindIII 进行双酶切。酶切反应在适宜的缓冲体系中进行，37℃孵育一定时间后，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并再次回收目的基因片段和线性化的载体。

连接与转化：将双酶切后的目的基因和载体按照一定比例混合，加入 T4 DNA 连接酶，在 16℃下连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于含有卡那霉素的 LB 平板上，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。

重组质粒的鉴定：挑取平板上的单菌落，接种于含有卡那霉素的 LB 液体培养基中，37℃振荡培养。提取质粒，采用限制性内切酶酶切和 DNA 测序的方法对重组质粒进行鉴定，确保插入的基因序列正确无误。

Ag85B 成熟蛋白的表达与纯化

蛋白表达：将鉴定正确的重组质粒转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落接种于含有卡那霉素的 LB 液体培养基中，37℃振荡培养至 OD₆₀₀约为 0.6 - 0.8。加入 IPTG（异丙基 - β - D - 硫代半乳糖苷）诱导蛋白表达，诱导条件（如 IPTG 浓度、诱导时间和温度）经过优化。收集诱导后的菌液，通过超声破碎细胞，释放蛋白。

蛋白纯化：采用镍 - 琼脂糖亲和层析柱对带有 His - Tag 标签的 Ag85B 成熟蛋白进行纯化。将破碎后的细胞上清液上样至亲和层析柱，用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱峰。通过 SDS - PAGE 电泳和 Western blotting 检测纯化后的蛋白纯度和分子量。

动物免疫实验

免疫方案：将纯化后的 Ag85B 成熟蛋白与弗氏完整佐剂等体积混合，充分乳化后，皮下注射 C57BL/6 小鼠，每只小鼠注射蛋白量为 50μg。初次免疫后，于第 2 周和第 4 周分别用弗氏不完整佐剂与蛋白混合进行加强免疫，剂量同初次免疫。同时设置对照组，注射 PBS 和佐剂的混合物。

免疫效果评价

细胞免疫反应检测：在末次免疫后 2 周，处死小鼠，分离脾淋巴细胞。采用 MTT 法检测脾淋巴细胞的增殖活性，以结核分枝杆菌特异性抗原刺激脾淋巴细胞，观察其增殖情况。通过流式细胞术检测 CD4⁺和 CD8⁺T 淋巴细胞的比例和细胞因子（如 IFN - γ、IL - 2、IL - 4 等）的分泌水平，评估细胞免疫应答状态。

体液免疫反应检测：采集小鼠血清，采用 ELISA 法检测血清中抗 - Ag85B 抗体的水平，包括 IgG、IgM 等不同类型抗体，以评估体液免疫应答。

免疫保护实验：末次免疫后 4 周，用结核分枝杆菌 H37Rv 菌株对小鼠进行气溶胶感染，感染剂量根据预实验确定。感染后定期观察小鼠的体重变化、生存率以及肺部病理变化。通过菌落计数法检测小鼠肺部结核分枝杆菌的载量，评估免疫保护效果。

三、结果

（一）Ag85B 成熟蛋白基因的克隆

PCR 扩增得到了预期大小的目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳显示条带清晰，大小与理论值相符。经胶回收后，获得了足够量的 Ag85B 成熟蛋白基因片段，可用于后续实验。

（二）表达载体的构建与鉴定

双酶切和 DNA 测序结果表明，成功构建了含有 Ag85B 成熟蛋白基因的重组表达载体 pET - 28a - Ag85B。重组质粒在大肠杆菌中能够稳定存在，为蛋白表达奠定了基础。

（三）Ag85B 成熟蛋白的表达与纯化

经 IPTG 诱导后，SDS - PAGE 电泳结果显示在预期分子量位置出现了明显的蛋白条带，表明 Ag85B 成熟蛋白在大肠杆菌中成功表达。通过镍 - 琼脂糖亲和层析柱纯化后，获得了高纯度的 Ag85B 成熟蛋白，Western blotting 结果进一步证实了纯化蛋白的正确性。

（四）动物免疫实验结果

细胞免疫反应

脾淋巴细胞增殖实验表明，免疫组小鼠脾淋巴细胞在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下增殖明显高于对照组。流式细胞术检测结果显示，免疫组小鼠 CD4⁺和 CD8⁺T 淋巴细胞比例显著增加，且 IFN - γ、IL - 2 等 Th1 型细胞因子分泌水平升高，提示产生了强烈的细胞免疫应答，以 Th1 型免疫反应为主。

体液免疫反应
ELISA 检测结果显示，免疫组小鼠血清中抗 - Ag85B 抗体水平明显升高，其中 IgG 抗体水平升高尤为显著，表明诱导了有效的体液免疫反应。

免疫保护效果

在免疫保护实验中，免疫组小鼠在结核分枝杆菌感染后体重下降幅度明显小于对照组，生存率显著提高。肺部病理检查发现，免疫组小鼠肺部炎症反应较轻，结核结节数量和大小均明显小于对照组。菌落计数结果显示，免疫组小鼠肺部结核分枝杆菌载量显著低于对照组，表明 Ag85B 成熟蛋白免疫能够为小鼠提供有效的免疫保护。

四、讨论

本研究成功克隆并表达了 Ag85B 成熟蛋白基因，通过动物免疫实验证实了其在结核病免疫中的良好效果。Ag85B 成熟蛋白能够诱导机体产生以 Th1 型为主的细胞免疫反应和较强的体液免疫反应，这对于抵抗结核分枝杆菌感染至关重要。

在细胞免疫方面，Th1 型细胞因子的分泌能够激活巨噬细胞等免疫细胞，增强其杀伤结核分枝杆菌的能力。同时，CD4⁺和 CD8⁺T 淋巴细胞的增殖和活化有助于形成长期的免疫记忆，为机体提供持久的保护。在体液免疫方面，抗体的产生可能通过多种机制参与抗结核免疫，如中和毒素、调理吞噬等。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，在动物模型选择上，仅使用了 C57BL/6 小鼠模型，对于其他动物模型或人类的适用性还需要进一步验证。此外，虽然 Ag85B 成熟蛋白显示出了良好的免疫效果，但在实际应用中，可能需要考虑与其他结核分枝杆菌抗原联合使用，以进一步提高免疫保护效果。同时，还需要深入研究其免疫机制，为疫苗的优化设计提供更充分的理论依据。

五、结论

本研究在 Ag85B 成熟蛋白基因结核病免疫研究方面取得了新突破。通过构建表达载体、纯化蛋白和进行动物免疫实验，证明了 Ag85B 成熟蛋白在诱导免疫反应和提供免疫保护方面的显著作用。这为新型结核病疫苗的研发和免疫治疗策略提供了有价值的参考，为进一步改善全球结核病防治现状带来了希望。未来的研究将围绕优化免疫方案、深入理解免疫机制以及开展临床试验等方面展开，以期早日将这一研究成果应用于临床实践。