蝉抗菌肽Cryptonin在毕赤酵母中的表达与鉴定

摘要：本研究聚焦于蝉抗菌肽 Cryptonin 在毕赤酵母中的表达与鉴定。通过基因克隆技术获取 Cryptonin 基因，构建重组表达载体并转化至毕赤酵母中。优化培养条件以提高表达量，利用多种蛋白纯化和鉴定方法，包括亲和层析、高效液相色谱、质谱分析及抗菌活性检测等，对表达产物进行全面分析。结果成功实现了 Cryptonin 在毕赤酵母中的高效表达，并证实了表达产物具有预期的抗菌活性，为 Cryptonin 的大规模生产和进一步的医药应用研究提供了有力支持。

一、引言

抗菌肽作为生物免疫系统中的重要组成部分，具有广谱抗菌活性、作用机制更好且不易产生耐药性等优点，成为近年来医药领域的研究热点。蝉抗菌肽 Cryptonin 是其中一种具有潜力的抗菌肽，在天然防御病原体入侵方面发挥关键作用。研究其在毕赤酵母中的表达与鉴定，对于开发新型抗菌药物具有重要意义。

毕赤酵母表达系统以其能够高效表达外源蛋白、易于基因操作、可对表达产物进行翻译后修饰等优势，被广泛应用于重组蛋白的生产。将 Cryptonin 在毕赤酵母中进行表达，有望实现其大规模生产，满足医药研发对大量高纯度抗菌肽的需求。本研究旨在建立稳定、高效的 Cryptonin 在毕赤酵母中的表达体系，并对表达产物进行准确鉴定，为后续的应用研究奠定基础。

二、材料与方法

（一）材料

菌株和载体
蝉来源的 Cryptonin 基因模板、毕赤酵母菌株 GS115、表达载体 pPICZαA。

试剂
限制性内切酶（如 EcoR I、Xba I）、T4 DNA 连接酶、DNA 聚合酶、琼脂糖、酵母提取物、蛋白胨、山梨醇、甲醇、各种抗生素、镍琼脂糖凝胶亲和层析柱、高效液相色谱（HPLC）分析所需的流动相试剂、用于质谱分析的基质等。

（二）方法

Cryptonin 基因的克隆
从蝉组织中提取总 RNA，通过逆转录 - 聚合酶链反应（RT - PCR）获得 Cryptonin 的 cDNA。设计特异性引物，在引物两端引入合适的限制性内切酶位点（如 EcoR I 和 Xba I），以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，得到带有酶切位点的 Cryptonin 基因片段。PCR 反应条件经过优化，包括退火温度、延伸时间等参数，确保扩增产物的特异性和产量。

重组表达载体的构建
将扩增得到的 Cryptonin 基因片段和表达载体 pPICZαA 分别用 EcoR I 和 Xba I 进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，使用凝胶回收试剂盒回收目的基因片段和线性化的载体。然后，在 T4 DNA 连接酶的作用下，将 Cryptonin 基因片段与线性化载体在 16℃下连接过夜，构建重组表达载体 pPICZαA - Cryptonin。连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，通过含有 Zeocin 的 LB 平板筛选阳性克隆。挑取阳性克隆进行菌落 PCR 和测序验证，确保重组载体中 Cryptonin 基因序列的正确性。

毕赤酵母的转化
将构建好的重组表达载体 pPICZαA - Cryptonin 用 Sac I 线性化，然后通过电转化的方法将线性化的重组载体导入毕赤酵母 GS115 感受态细胞中。电转化参数经过优化，包括电压、电容和电阻等，以提高转化效率。转化后的细胞涂布在含有 Zeocin 的 YPDS 平板上，在 30℃下培养 2 - 3 天，筛选出阳性转化子。

重组毕赤酵母的筛选与鉴定
对筛选出的阳性转化子进行菌落 PCR 鉴定，使用载体上的通用引物和 Cryptonin 基因特异性引物，验证 Cryptonin 基因是否成功整合到毕赤酵母基因组中。同时，提取阳性转化子的基因组 DNA，通过 Southern blotting 进一步确认基因整合情况，确定单拷贝和多拷贝整合的转化子。

重组毕赤酵母的培养与诱导表达
将筛选得到的阳性转化子接种至含有一定浓度 Zeocin 的 BMGY 培养基中，在 30℃、250rpm 的条件下培养至 OD₆₀₀约为 2 - 6。然后，离心收集细胞，用 BMMY 培养基重悬，并添加甲醇至终浓度为 0.5% - 1.0% 进行诱导表达。诱导过程在 30℃下持续进行，每隔 24 小时添加一次甲醇以维持诱导状态。同时，设置不同的诱导时间（24、48、72、96 小时等）和甲醇浓度梯度（0.5%、0.75%、1.0%、1.25% 等），通过 SDS - PAGE 分析蛋白表达情况，优化表达条件，以获得最高的 Cryptonin 表达量。

表达产物的纯化
诱导表达结束后，离心收集培养液，通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对表达产物进行初步纯化。将培养液上样至平衡好的亲和层析柱，用含有低浓度咪唑（如 20 - 50mM）的缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白，然后用含有高浓度咪唑（如 200 - 500mM）的缓冲液进行洗脱，收集含有 Cryptonin 的洗脱峰。对初步纯化的产物进一步采用高效液相色谱（HPLC）进行精细纯化，选择合适的色谱柱和流动相条件，根据蛋白的保留时间收集目标峰。

表达产物的鉴定

质谱分析：对纯化后的蛋白样品进行质谱分析，包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF - MS）和电喷雾离子化质谱（ESI - MS），测定蛋白的分子量，并与理论分子量进行对比，确定表达产物是否为目标蛋白 Cryptonin。

N - 末端氨基酸序列测定：采用 Edman 降解法测定纯化后蛋白的 N - 末端氨基酸序列，与已知的 Cryptonin 氨基酸序列进行比对，进一步验证蛋白的正确性。

抗菌活性检测：采用琼脂扩散法和液体稀释法检测纯化后的 Cryptonin 对多种常见病原菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等）的抗菌活性。在琼脂扩散法中，将病原菌均匀涂布在琼脂平板上，在平板上打孔，加入不同浓度的 Cryptonin 溶液，培养后观察抑菌圈大小。在液体稀释法中，将 Cryptonin 溶液与病原菌菌液混合，在一定温度下培养一定时间后，通过测定菌液的吸光度或平板计数法确定低抑菌浓度（MIC）和低杀菌浓度（MBC）。

三、结果

（一）Cryptonin 基因的克隆与重组表达载体的构建

通过 RT - PCR 成功扩增出 Cryptonin 基因片段，大小与预期相符。构建的重组表达载体 pPICZαA - Cryptonin 经菌落 PCR 和测序验证，表明 Cryptonin 基因已正确插入到载体中，且序列无突变。

（二）毕赤酵母的转化与阳性转化子的筛选

电转化后，在含有 Zeocin 的 YPDS 平板上筛选出多个阳性转化子。菌落 PCR 和 Southern blotting 结果显示，部分转化子中 Cryptonin 基因成功整合到毕赤酵母基因组中，其中包括单拷贝和多拷贝整合的转化子。

（三）重组毕赤酵母的培养与诱导表达优化

通过优化诱导时间和甲醇浓度，SDS - PAGE 结果显示，在诱导 72 小时、甲醇浓度为 1.0% 时，Cryptonin 的表达量最高。表达的蛋白在分子量大小上与理论值相符，主要以可溶形式存在于培养液中。

（四）表达产物的纯化

经过镍琼脂糖凝胶亲和层析和 HPLC 纯化后，获得了纯度较高的 Cryptonin 蛋白，SDS - PAGE 显示单一清晰的条带。

（五）表达产物的鉴定

质谱分析：MALDI - TOF - MS 和 ESI - MS 结果表明，纯化后的蛋白分子量与理论分子量基本一致，误差在允许范围内，证实为 Cryptonin。

N - 末端氨基酸序列测定：Edman 降解法测得的 N - 末端氨基酸序列与已知的 Cryptonin 序列匹配，进一步确认了蛋白的身份。

抗菌活性检测：琼脂扩散法和液体稀释法结果显示，表达的 Cryptonin 对测试的多种病原菌具有显著的抗菌活性，其 MIC 和 MBC 值在一定范围内，表明具有良好的抗菌效果。

四、讨论

（一）基因克隆与载体构建的要点

在 Cryptonin 基因克隆过程中，引物设计至关重要，合适的限制性内切酶位点选择确保了基因与载体的正确连接。同时，PCR 反应条件的优化对于获得高质量、特异性的基因片段起到关键作用。在重组表达载体构建时，连接反应的条件如温度和时间需要精确控制，以提高连接效率和减少载体自连。

（二）毕赤酵母转化与筛选的问题

电转化过程中，参数的优化对于提高转化效率至关重要。不同的毕赤酵母菌株可能对电转化参数有不同的要求，需要进行摸索。在筛选阳性转化子时，菌落 PCR 和 Southern blotting 两种方法相结合能够更准确地确定基因整合情况，尤其是区分单拷贝和多拷贝整合，这对于后续表达量的调控有重要意义。

（三）表达条件优化的意义

通过对诱导时间和甲醇浓度的优化，能够显著提高 Cryptonin 的表达量。甲醇作为诱导剂，其浓度过高可能对细胞产生毒性，影响蛋白表达和细胞活性；浓度过低则无法有效诱导蛋白表达。合适的诱导时间也需要根据细胞生长状态和蛋白表达动态来确定，这需要大量的实验摸索。

（四）纯化与鉴定方法的选择

镍琼脂糖凝胶亲和层析对于带有组氨酸标签的重组蛋白具有较好的纯化效果，但可能存在一些非特异性吸附，需要通过优化洗涤和洗脱条件来提高纯度。HPLC 作为一种高分辨率的纯化方法，能够进一步去除杂质，获得高纯度的蛋白。在鉴定方面，质谱分析和 N - 末端氨基酸序列测定从不同角度对蛋白进行了准确鉴定，而抗菌活性检测则直接验证了表达产物的功能，为其应用价值提供了依据。

五、结论

本研究成功实现了蝉抗菌肽 Cryptonin 在毕赤酵母中的高效表达，并通过多种方法对表达产物进行了准确的纯化和鉴定。表达的 Cryptonin 具有良好的抗菌活性，为其进一步的大规模生产和在医药领域的应用研究提供了重要的实验数据和技术支持。未来可进一步研究 Cryptonin 的作用机制，优化表达体系以提高产量，并开展其在体内的抗菌效果和安全性评估等相关研究。