蝉新型抗菌肽人外周血单核细胞分离与转染

摘要：本文聚焦于蝉新型抗菌肽与人外周血单核细胞（PBMCs）之间的相互作用。详细描述了 PBMCs 的分离方法、蝉新型抗菌肽的特性，以及将抗菌肽转染至 PBMCs 的实验流程。通过一系列实验分析，探讨了这种转染对于 PBMCs 功能的影响，包括免疫调节、抗菌活性等方面，为开发新型抗菌免疫疗法提供了理论依据和实验基础。

一、引言

在当今的医学和生物学研究领域，寻找新型抗菌药物和增强机体自身免疫防御能力是至关重要的课题。抗菌肽作为天然免疫系统的关键组成部分，具有广谱抗菌活性和更好的免疫调节功能。近年来，从昆虫中发现的新型抗菌肽受到了广泛关注，其中蝉新型抗菌肽展现出了良好的抗菌潜力。

人外周血单核细胞是免疫系统中的重要细胞成分，参与免疫应答、炎症反应等多种生理过程。将蝉新型抗菌肽引入人外周血单核细胞，有望赋予这些细胞更强的抗菌能力，并调节其免疫功能，为治疗细菌感染性疾病和免疫相关疾病开辟新的途径。然而，要实现这一目标，首先需要建立稳定可靠的人外周血单核细胞分离和转染方法，同时深入了解转染后细胞的生物学特性变化。

二、材料与方法

（一）样本采集

从健康志愿者（经过伦理委员会批准和志愿者知情同意）中采集外周静脉血，使用含有抗凝剂（如肝素钠）的真空采血管，采血量一般为 10 - 20ml。采集后，应在 2 - 4 小时内进行后续处理，以保证细胞活性。

（二）人外周血单核细胞（PBMCs）的分离

密度梯度离心法

将采集的血液样本轻轻颠倒混匀后，缓慢加在淋巴细胞分离液（如 Ficoll - Paque Plus）上，注意保持两者之间的界面清晰。血液与淋巴细胞分离液的体积比例一般为 2:1。

将离心管置于水平离心机中，以 400 - 800g 的离心力离心 20 - 30 分钟（离心机升速和降速设置为低或最慢档，以避免界面破坏）。离心后，可见血液样本分层，上层为血浆层，中间白色云雾状层即为 PBMCs 层，下层为红细胞和粒细胞沉淀。

使用无菌吸管小心地将 PBMCs 层吸出，转移至新的离心管中。然后用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，离心（300 - 500g，10 分钟），弃去上清液。重复洗涤 2 - 3 次，以去除残留的淋巴细胞分离液和血浆成分。

磁珠分选法（可选步骤，用于进一步纯化）

根据 PBMCs 表面标志物（如 CD14 用于单核细胞）选择相应的磁珠标记抗体。将洗涤后的 PBMCs 重悬于含有磁珠标记抗体的缓冲液中，在 4℃下孵育 15 - 30 分钟，使抗体与细胞表面标志物充分结合。

将孵育后的细胞悬液通过磁场分离柱，标记有磁珠的单核细胞会被吸附在柱上，而其他细胞则流出。然后用缓冲液冲洗分离柱，去除未结合的细胞。最后将分离柱从磁场中取出，用洗脱液将吸附的单核细胞洗脱下来，得到纯化的 PBMCs。

（三）蝉新型抗菌肽的制备与鉴定

抗菌肽的提取与纯化
从蝉体组织中提取抗菌肽，可采用匀浆、酸提取、盐析等方法。例如，将采集的蝉体在液氮中研磨成粉末后，加入酸性缓冲液（如乙酸 - 乙酸钠缓冲液，pH 4 - 5），在低温下搅拌提取数小时。然后通过盐析（如使用硫酸铵）沉淀蛋白质，离心收集沉淀。再利用柱层析技术（如反相高效液相色谱、离子交换色谱等）进一步纯化抗菌肽，通过检测各洗脱峰的抗菌活性和分析其蛋白质谱图，确定含有抗菌肽的组分。

抗菌肽的鉴定

质谱分析：采用质谱仪（如 MALDI - TOF - MS、ESI - MS）对纯化后的抗菌肽进行分子量测定和氨基酸序列分析。通过与已知的抗菌肽数据库进行比对，初步确定其种类和结构特征。

抗菌活性测定：采用纸片扩散法、微量肉汤稀释法等检测抗菌肽对常见病原菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等）的抑制活性。同时，设置阳性对照（如已知的标准抗菌药物）和阴性对照（如缓冲液），以评估抗菌肽的抗菌效能。

（四）抗菌肽转染人外周血单核细胞

转染试剂的选择
评估多种转染试剂（如脂质体转染试剂、阳离子聚合物转染试剂等）对 PBMCs 的适用性。通过比较不同转染试剂在不同浓度下对细胞的毒性（采用细胞活力检测方法，如 MTT 法、CCK - 8 法）和转染效率（可通过转染带有荧光标记的抗菌肽模拟物，然后用荧光显微镜或流式细胞仪检测），选择最佳的转染试剂。

转染条件优化

在选定转染试剂后，优化转染条件。包括转染试剂与抗菌肽的比例、细胞接种密度、转染时间等。例如，在不同的转染试剂与抗菌肽比例（如 1:1、2:1、3:1 等）下，将不同密度（如 1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶个 /ml）的 PBMCs 接种于培养板中，在不同的转染时间（如 2、4、6 小时）后检测转染效率和细胞活性。

转染步骤：将 PBMCs 接种于合适的培养容器（如 24 孔板、6 孔板）中，培养在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的 RPMI 1640 培养基中，在 37℃、5% CO₂的培养箱中培养至合适的细胞状态（一般为 70 - 80% 汇合度）。将抗菌肽与转染试剂按照优化后的比例在无血清培养基中混合，轻轻涡旋混匀后，室温下孵育 15 - 30 分钟，形成转染复合物。然后将转染复合物缓慢滴加到培养的 PBMCs 中，轻轻摇晃培养板使复合物均匀分布。继续在培养箱中培养，在转染后的不同时间点（如 24、48、72 小时）进行后续分析。

（五）转染后细胞功能检测

抗菌活性检测

将转染后的 PBMCs 与不同浓度的病原菌（如细菌悬液，调整至合适的菌落形成单位，CFU）共培养。在一定时间（如 2 - 24 小时）后，通过菌落计数法、比浊法等检测细菌的生长情况，以评估转染抗菌肽后 PBMCs 的抗菌能力。同时设置未转染抗菌肽的 PBMCs 对照组和单独病原菌对照组。

采用活 - 死细菌染色法（如使用 SYTO 9 和碘化丙啶混合染料），通过荧光显微镜观察转染抗菌肽的 PBMCs 对病原菌的杀伤效果，直观地分辨活细菌（绿色荧光）和死细菌（红色荧光）。

免疫调节功能检测

细胞因子检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术微球阵列技术（CBA）检测转染后 PBMCs 分泌的细胞因子（如白细胞介素 - 1β、白细胞介素 - 6、肿瘤坏死因子 - α 等）的水平变化。收集转染后不同时间点（如 24、48、72 小时）的细胞培养上清液，按照试剂盒说明书进行操作，分析细胞因子分泌量的改变，以评估抗菌肽对 PBMCs 免疫调节功能的影响。

免疫细胞表型分析：利用流式细胞仪检测转染抗菌肽后 PBMCs 表面免疫标志物（如 CD4、CD8、HLA - DR 等）的表达变化。将转染后的细胞用荧光标记的抗体（针对相应的免疫标志物）进行染色，然后通过流式细胞仪分析不同免疫细胞亚群的比例和标志物表达强度的变化，了解抗菌肽对 PBMCs 免疫细胞分化和活化状态的作用。

三、结果

（一）PBMCs 的分离效果

通过密度梯度离心法结合磁珠分选（如果进行了这一步骤），成功获得了纯度较高的人外周血单核细胞。经流式细胞术检测，CD14⁺单核细胞的纯度可达 80% - 90% 以上，细胞活力良好，为后续实验提供了可靠的细胞来源。

（二）蝉新型抗菌肽的特性

从蝉体组织中成功提取并纯化出了新型抗菌肽，质谱分析结果显示其分子量和氨基酸序列与预期相符，与数据库中已知抗菌肽有一定的相似性但又具有更好的结构特征。抗菌活性测定表明，该抗菌肽对多种测试病原菌具有显著的抑制作用，其低抑菌浓度（MIC）和低杀菌浓度（MBC）与部分已知抗菌肽相当或更优。

（三）转染效率和细胞活性

经过对转染试剂和条件的优化，确定了最佳的转染方案。在该方案下，转染效率可达到 30% - 50%（通过荧光标记的抗菌肽模拟物检测），同时细胞活力保持在 70% - 80% 以上（通过 MTT 法检测）。不同的转染试剂和条件对转染效率和细胞活性有显著影响，如脂质体转染试剂在特定比例下表现出较好的转染效果，但高浓度时会对细胞产生一定毒性。

（四）转染后细胞功能变化

抗菌活性增强
转染蝉新型抗菌肽后的 PBMCs 对病原菌的抗菌能力明显增强。在与病原菌共培养实验中，与未转染的对照组相比，转染组能够显著降低细菌的生长数量，且随着抗菌肽转染量的增加和培养时间的延长，抗菌效果更加显著。活 - 死细菌染色结果直观地显示了转染抗菌肽的 PBMCs 周围死细菌数量增多，表明其对病原菌有直接的杀伤作用。

免疫调节功能改变
ELISA 和 CBA 结果显示，转染抗菌肽后 PBMCs 分泌的细胞因子水平发生了变化，部分炎症相关细胞因子（如白细胞介素 - 1β、肿瘤坏死因子 - α）在转染后的早期（24 - 48 小时）有一定程度的升高，提示抗菌肽可能激活了 PBMCs 的免疫应答。流式细胞仪分析表明，转染后免疫细胞表面标志物的表达也有改变，如 HLA - DR 的表达上调，表明 PBMCs 的免疫激活状态增强。

四、讨论

（一）分离和转染方法的评价

本研究中采用的 PBMCs 分离方法，尤其是密度梯度离心结合磁珠分选技术，能够有效地获得高纯度的单核细胞，但操作过程需要严格的无菌技术和精确的操作技巧，以避免细胞污染和损失。在转染过程中，转染试剂和条件的优化是关键步骤。不同的转染试剂对细胞的适用性差异较大，需要综合考虑转染效率和细胞毒性。本研究确定的最佳转染方案在一定程度上平衡了这两个因素，但仍有改进的空间，例如进一步探索新型的低毒高效转染试剂或联合使用多种转染方法。

（二）抗菌肽对 PBMCs 功能的影响机制

蝉新型抗菌肽转染后增强了 PBMCs 的抗菌活性，这可能是由于抗菌肽本身的直接杀菌作用以及其对 PBMCs 免疫激活的协同效应。抗菌肽可能通过与 PBMCs 细胞膜上的受体结合，激活细胞内的信号通路，从而促进抗菌物质的释放和免疫细胞的活化。在免疫调节方面，抗菌肽诱导的细胞因子分泌变化和免疫标志物表达改变提示其可能参与了免疫细胞的分化和功能调节过程，进一步影响了机体的免疫应答。然而，具体的分子机制仍需要深入的研究，例如通过基因表达谱分析、蛋白质相互作用研究等方法来阐明抗菌肽在 PBMCs 内的作用靶点和信号传导途径。

（三）研究的意义和局限性

本研究成功建立了蝉新型抗菌肽人外周血单核细胞分离与转染体系，并初步探讨了转染后细胞的功能变化，为开发基于抗菌肽的新型抗菌免疫疗法提供了实验依据。这种疗法有望在治疗细菌感染性疾病，特别是耐药菌感染方面发挥积极作用。同时，也为进一步理解抗菌肽与免疫系统的相互作用机制提供了新的视角。然而，本研究也存在一定的局限性，如实验仅在体外进行，体内复杂的生理环境可能会对转染效果和细胞功能产生影响。此外，对于抗菌肽长期作用下 PBMCs 的安全性和潜在副作用尚未完整明确，需要进一步的体内实验和长期观察来评估。

五、结论

综上所述，我们通过优化的方法成功分离了人外周血单核细胞，并实现了蝉新型抗菌肽的有效转染。转染后的 PBMCs 在抗菌活性和免疫调节功能方面都有显著变化。尽管研究存在一定局限性，但本工作为后续的抗菌肽应用研究和新型抗菌免疫治疗策略的开发奠定了坚实的基础，为深入探索抗菌肽与免疫系统相互作用机制提供了有价值的参考。未来的研究应进一步完善实验体系，深入探究其作用机制，并开展体内实验以评估其临床应用潜力。