电穿孔转染法电场强度优化与基因表达效率

摘要：本研究聚焦于电穿孔转染法中电场强度这一关键参数，通过一系列实验对其进行优化以提高基因表达效率。详细阐述了电穿孔转染的原理、不同电场强度对细胞生理状态和基因转染效率的影响，并对实验结果进行深入分析。研究结果为电穿孔转染技术在基因治疗、细胞生物学研究等领域的更高效应用提供了重要参考，有助于推动相关领域向更精准、更有效的方向发展。

一、引言

在现代生物技术领域，基因转染技术是将外源基因导入细胞的关键手段，对于基因功能研究、基因治疗等众多方面具有至关重要的意义。电穿孔转染法作为一种广泛应用的物理转染方法，利用短暂的高电场脉冲在细胞膜上形成可逆性的微孔，从而使外源 DNA 能够进入细胞。然而，电场强度作为电穿孔转染过程中的关键参数，直接影响转染效率和细胞的存活状态。过高的电场强度可能导致细胞不可逆损伤，而过低则无法有效形成足够的膜孔使外源基因进入细胞，进而影响基因表达效率。因此，对电穿孔转染法电场强度的优化研究迫在眉睫，这将为提高基因转染的成功率和基因表达水平提供有力支持，为生命科学研究开辟更广阔的前景。

二、材料与方法

（一）细胞系与试剂

细胞系
选取常用的哺乳动物细胞系，如 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞系）、CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞系）作为研究对象。这些细胞系具有生长特性明确、易于培养等优点，广泛应用于转染实验研究。

试剂

培养基：根据细胞类型选择合适的培养基，如 HeLa 细胞使用 DMEM 高糖培养基，CHO 细胞使用 Ham's F - 12 培养基，均添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素混合液。

外源 DNA：选用带有报告基因（如绿色荧光蛋白基因 GFP）的质粒 DNA，通过标准的分子生物学技术进行提取和纯化，确保 DNA 的纯度和完整性。

电穿孔缓冲液：使用专门配制的电穿孔缓冲液，其成分经过优化，能够在电穿孔过程中维持细胞的生理状态，减少对细胞的损伤。

（二）电穿孔设备

采用先进的电穿孔仪，该仪器能够精确控制电场强度、脉冲时间和脉冲次数等参数。电穿孔仪配备不同类型的电穿孔 cuvette（小室），其电极间距和容积根据实验需求进行选择，以适应不同细胞浓度和体积的转染实验。

（三）实验设计

细胞准备
将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，用预冷的电穿孔缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至合适范围（如 HeLa 细胞为 1×10⁶ - 5×10⁶个 /mL，CHO 细胞为 2×10⁶ - 6×10⁶个 /mL）。

电穿孔转染

将细胞悬液与等体积的含有外源 DNA 的溶液混合，加入到电穿孔 cuvette 中。设置不同的电场强度梯度，范围从 50V/cm 到 2000V/cm，每次增加 100 - 200V/cm。脉冲时间固定为若干微秒（如 50μs），脉冲次数设定为 1 - 3 次。

在每个电场强度条件下，进行多次重复实验（如 n = 3 - 5），以确保数据的准确性和可靠性。

转染后处理
电穿孔转染完成后，迅速将细胞转移至含有完整培养基的培养皿中，在 37℃、5% CO₂的培养箱中培养。分别在转染后 24、48、72 小时等不同时间点进行后续检测。

（四）检测方法

细胞活力检测
采用台盼蓝拒染法结合细胞计数仪来评估细胞活力。在转染后特定时间点，取一定量的细胞悬液与台盼蓝溶液混合，然后在细胞计数仪上进行计数。活细胞能够排斥台盼蓝，而死细胞则被染成蓝色，通过计算活细胞的比例来确定细胞活力。

基因表达效率检测

荧光显微镜观察：对于转染带有 GFP 基因的细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。通过随机选取多个视野，统计发出绿色荧光的细胞数量，计算转染阳性细胞的比例，以此初步评估基因转染效率。

流式 cytometry（流式细胞术）分析：将细胞用胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，通过流式细胞仪对 GFP 阳性细胞进行定量分析。流式细胞仪能够精确地检测每个细胞的荧光强度，根据荧光强度的阈值设定，可以准确计算出转染阳性细胞的百分比和平均荧光强度，更准确地反映基因表达效率。

定量 PCR（qPCR）检测：提取细胞总 RNA，反转录为 cDNA，然后使用特异性引物对目的基因（GFP 或其他相关基因）进行定量 PCR 分析。通过与内参基因（如 GAPDH）的比较，计算目的基因的相对表达量，从转录水平进一步验证基因表达效率。

Western blotting 检测：提取细胞总蛋白，进行 SDS - PAGE 电泳，将蛋白转移至 PVDF 膜上，用特异性抗体（如抗 - GFP 抗体）进行免疫印迹检测。通过检测目的蛋白的表达水平，从翻译水平确定基因表达情况，并结合蛋白条带的灰度分析进行定量比较。

三、结果

（一）细胞活力与电场强度的关系

随着电场强度的增加，细胞活力呈现出先相对稳定后逐渐下降的趋势。在较低电场强度范围（50 - 800V/cm）内，细胞活力保持在较高水平（约 80% - 95%），表明在此电场强度下，细胞受到的损伤较小。然而，当电场强度超过 1000V/cm 时，细胞活力开始明显下降，在 2000V/cm 时，细胞活力可能降低至 30% - 50% 左右，说明过高的电场强度对细胞造成了严重的不可逆损伤。

（二）基因转染效率与电场强度的关系

荧光显微镜观察结果
在较低电场强度下（50 - 600V/cm），转染阳性细胞数量较少，仅在视野中观察到零星的绿色荧光细胞。随着电场强度的升高，转染阳性细胞比例逐渐增加，在 800 - 1200V/cm 范围内达到一个峰值，此时视野中绿色荧光细胞数量明显增多。但当电场强度进一步升高超过 1500V/cm 时，转染阳性细胞比例反而有所下降，同时部分细胞出现过度损伤的形态特征，如细胞膜破裂、细胞皱缩等。

流式 cytometry 分析结果
流式细胞术定量分析结果与荧光显微镜观察结果趋势一致。在 800 - 1200V/cm 电场强度区间，转染阳性细胞百分比和平均荧光强度均达到较高值，表明基因转染效率在此区间最高。与低电场强度（50 - 600V/cm）相比，转染阳性细胞百分比可从不足 10% 提高到 40% - 60% 左右，平均荧光强度也有显著增强。而在高电场强度（> 1500V/cm）下，转染阳性细胞百分比和平均荧光强度均出现下降趋势。

定量 PCR 和 Western blotting 检测结果
qPCR 检测显示，在 800 - 1200V/cm 电场强度下，目的基因（GFP）的相对转录水平最高，与转染阳性细胞比例的变化趋势相符。Western blotting 结果也表明，在此电场强度区间内，目的蛋白（GFP）的表达量在翻译水平上达到峰值，蛋白条带的灰度值较好，进一步证实了基因表达效率在该电场强度范围内优异。

四、讨论

（一）电场强度对细胞生理的影响机制

在电穿孔过程中，电场强度直接作用于细胞膜，引起细胞膜脂质双分子层的重排和局部破坏。在较低电场强度下，形成的膜孔较小且数量有限，能够在脉冲结束后迅速闭合，对细胞的生理功能影响较小，这使得细胞在转染后仍能保持较高的活力。然而，随着电场强度的增加，膜孔的大小和数量增多，细胞膜的通透性过度增加，导致细胞内的离子平衡、代谢物质等发生紊乱，同时可能引起细胞膜结构的不可逆破坏，进而使细胞活力下降。

（二）电场强度对基因转染效率的影响机制

当电场强度处于合适范围时，足够数量和大小的膜孔能够允许外源 DNA 顺利进入细胞。在 800 - 1200V/cm 这个优化的电场强度区间内，细胞膜形成了有利于外源 DNA 进入的适度孔隙结构，同时细胞的生理状态在转染后仍能维持较好，使得进入细胞的外源 DNA 能够有效地进行转录和翻译，从而提高基因表达效率。而在过高或过低的电场强度下，要么膜孔形成不足无法有效摄取外源 DNA，要么细胞受到严重损伤无法正常进行基因表达，导致转染效率降低。

（三）不同检测方法的互补性

本研究采用了多种检测方法来评估细胞活力和基因转染效率，这些方法相互补充。荧光显微镜观察能够直观地显示转染阳性细胞的分布情况，但对于转染效率的定量分析不够精确。流式 cytometry 则可以准确地定量转染阳性细胞的比例和平均荧光强度，从单个细胞水平更精细地评估基因转染情况。定量 PCR 和 Western blotting 分别从转录和翻译水平进一步验证基因表达效率，为转染效果的全面评价提供了多维度的数据支持。

五、结论

通过对电穿孔转染法中电场强度这一关键参数的系统研究，我们发现对于 HeLa 细胞和 CHO 细胞，在 800 - 1200V/cm 的电场强度范围内，能够在保证细胞活力的同时实现较高的基因转染效率和基因表达水平。本研究结果为电穿孔转染技术在基因治疗、细胞生物学研究等领域的应用提供了重要的实验依据和参数优化指导，有助于进一步提高电穿孔转染技术的效果，推动相关领域的研究进展。未来的研究可以在此基础上，进一步探索其他影响电穿孔转染的因素，如脉冲时间、脉冲次数、细胞类型特异性等，以实现更精准、更高效的基因转染。