方波脉冲电穿孔法优化酵母细胞通透性条件

摘要：本文深入研究了方波脉冲电穿孔法对酵母细胞通透性的影响，并对其优化条件进行了系统探索。详细阐述了实验原理、材料与方法，包括酵母菌株的选择、方波脉冲电穿孔参数的设置与调整，以及对细胞通透性检测的多种方法。通过大量实验数据分析，确定了能够有效提高酵母细胞通透性的最佳电穿孔条件，为酵母细胞在生物技术领域的应用，如基因转化、代谢工程等方面提供了重要的理论和实践依据，有助于拓展酵母细胞作为细胞工厂的潜力。

一、引言

酵母作为一种重要的模式生物和工业微生物，在发酵工业、生物制药、基因工程等众多领域有着广泛的应用。酵母细胞的通透性是影响其在这些应用中效率的关键因素之一。例如，在基因转化过程中，需要将外源 DNA 有效地导入酵母细胞内；在代谢工程中，对细胞内代谢产物的提取或底物的输入也与细胞通透性密切相关。

传统的提高细胞通透性的方法存在一定的局限性，而方波脉冲电穿孔法作为一种物理手段，具有潜在的优势。它可以在短时间内通过电脉冲在细胞膜上形成可逆性的孔道，从而增强细胞对各种物质的通透性。然而，电穿孔效果受到多种因素的影响，如脉冲强度、脉冲宽度、脉冲次数、细胞浓度等。因此，深入研究并优化方波脉冲电穿孔法的条件对于更好地控制酵母细胞通透性具有重要意义。本研究旨在通过系统的实验，精确确定方波脉冲电穿孔法优化酵母细胞通透性的最佳条件，为酵母细胞相关的生物技术应用提供有力支持。

二、材料与方法

（一）酵母菌株与培养条件

菌株选择
选用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为实验菌株，该菌株在工业和科研领域应用广泛，具有代表性。从实验室保存的菌株库中获取酿酒酵母菌株，通过平板划线法在酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YPD）固体培养基上进行活化，30℃培养 48 小时，挑取单菌落转接至液体 YPD 培养基中，在 30℃、180rpm 的摇床中振荡培养至对数生长期。

细胞收集与预处理
将处于对数生长期的酵母细胞培养液离心（3000rpm，5 分钟），弃去上清液。用无菌的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤细胞 2 - 3 次，然后重新悬浮于适量的 PBS 中，调整细胞浓度至不同的设定值，如 1×10⁶ - 1×10⁸ 个 /mL，用于后续的电穿孔实验。

（二）方波脉冲电穿孔设备与参数设置

电穿孔设备
使用专门的方波脉冲电穿孔仪，该仪器能够精确控制脉冲的各种参数，包括脉冲强度（电压）、脉冲宽度（持续时间）、脉冲次数等。

参数设置与优化

脉冲强度：设置不同的电压值范围，从 100V - 1000V，以 100V 为间隔，在初始实验中探索电压对细胞通透性的大致影响。

脉冲宽度：选择脉冲宽度在 1 - 100 微秒范围内，以 10 微秒为间隔，研究其对细胞通透性的作用。

脉冲次数：设置脉冲次数从 1 - 10 次，每次增加 1 次，考察多次脉冲对细胞通透性的累积效应。

（三）细胞通透性检测方法

荧光标记物摄取实验
选用一种膜不通透性的荧光标记物，如荧光素二乙酸酯（FDA）。将经过电穿孔处理后的酵母细胞与一定浓度的 FDA 溶液混合，在 30℃下孵育一段时间（如 30 分钟）。然后通过荧光显微镜观察细胞内的荧光强度。荧光强度越高，说明细胞摄取的 FDA 越多，即细胞通透性越好。同时，使用流式细胞仪对细胞荧光强度进行定量分析，以更准确地评估细胞通透性的变化。

电导率测量法
由于细胞通透性增加会导致细胞内离子释放到细胞外，引起溶液电导率的变化。将电穿孔后的酵母细胞悬液置于电导率测量池中，使用电导率仪测量溶液电导率的变化。与未经电穿孔处理的对照细胞悬液电导率进行比较，电导率增加幅度越大，表明细胞通透性提高越显著。

基因转化效率评估
利用一种含有可检测标记基因（如绿色荧光蛋白基因，GFP）的质粒 DNA 进行电穿孔转化实验。将一定量的质粒 DNA 与经过不同电穿孔条件处理的酵母细胞混合进行电穿孔。电穿孔后，将细胞接种于含有相应筛选抗生素的固体培养基上，30℃培养 48 - 72 小时，计数长出的转化子菌落数。通过比较不同电穿孔条件下的转化子数量，间接评估细胞通透性对基因转化效率的影响，转化子数量越多，说明在该电穿孔条件下细胞通透性更有利于外源 DNA 的导入。

三、结果

（一）脉冲强度对酵母细胞通透性的影响

当脉冲强度在较低范围（100 - 300V）时，通过荧光标记物摄取实验和电导率测量发现，细胞通透性仅有轻微增加。随着脉冲强度升高到 400 - 600V，细胞内荧光强度明显增强，电导率也显著增加，表明细胞通透性得到了较好的改善。然而，当脉冲强度超过 700V 时，虽然细胞通透性在短期内进一步提高，但通过后续的细胞活力检测（如台盼蓝染色法）发现，细胞死亡率大幅上升，表明过高的脉冲强度对细胞造成了不可逆的损伤。

（二）脉冲宽度对酵母细胞通透性的影响

在脉冲宽度为 1 - 10 微秒时，细胞对荧光标记物的摄取和电导率变化不明显。当脉冲宽度增加到 20 - 50 微秒时，细胞通透性逐渐提高，在 50 微秒左右达到一个相对较高的水平。继续增加脉冲宽度超过 60 微秒，细胞通透性的提升趋势减缓，且出现细胞活力下降的情况，可能是由于过长的脉冲宽度导致细胞膜修复困难，影响了细胞的正常生理功能。

（三）脉冲次数对酵母细胞通透性的影响

单次脉冲时，细胞通透性有一定程度的增加，但效果有限。随着脉冲次数从 2 次增加到 6 次，通过基因转化效率评估和荧光标记物摄取实验可知，细胞通透性呈逐步上升趋势。然而，当脉冲次数超过 6 次后，细胞通透性的增加不明显，且由于多次脉冲对细胞的累积损伤，细胞活力下降，转化效率也不再提高，甚至略有降低。

（四）细胞浓度对电穿孔效果的影响

在较低细胞浓度（1×10⁶ 个 /mL）时，电穿孔对细胞通透性的提高效果相对较好，但由于细胞数量少，对于需要大量细胞的应用不太实用。随着细胞浓度升高到 1×10⁷ - 5×10⁷ 个 /mL，在合适的脉冲参数下，仍能保持较好的细胞通透性，同时满足一定的实验规模需求。但当细胞浓度过高（超过 5×10⁷ 个 /mL）时，由于细胞之间的相互作用和电场分布的不均匀性，电穿孔效果变差，细胞通透性降低。

四、讨论

通过对脉冲强度、脉冲宽度、脉冲次数和细胞浓度等因素的系统研究，我们确定了方波脉冲电穿孔法优化酵母细胞通透性的最佳条件范围。在实际应用中，需要综合考虑细胞的存活率和所需的通透性水平。例如，对于一些对细胞活力要求较高的基因功能研究，可能需要选择相对温和的电穿孔条件，即使通透性的提高幅度不是最大，但能保证细胞在电穿孔后仍能正常生长和表达基因。而对于一些以物质导入或提取为主要目的的应用，如高效的基因转化或细胞内代谢产物的快速提取，可以在细胞存活率允许的范围内，适当提高脉冲强度等参数来增强细胞通透性。

此外，不同的酵母菌株或经过特殊处理的酵母细胞（如细胞壁缺陷型菌株）可能对电穿孔条件有不同的响应。未来的研究可以进一步探索这些特殊情况下的电穿孔优化策略，以及研究电穿孔过程中细胞膜的修复机制，以便更好地控制细胞通透性和细胞的生理状态。同时，将电穿孔技术与其他提高细胞通透性的方法相结合，可能会开发出更高效、更温和的细胞处理技术，为酵母细胞在生物技术领域的更广泛应用提供新的途径。

五、结论

本研究通过对方波脉冲电穿孔法中多个关键参数的优化，确定了在保证酵母细胞一定存活率的前提下，提高细胞通透性的最佳条件。脉冲强度在 400 - 600V、脉冲宽度在 50 微秒左右、脉冲次数为 6 次，细胞浓度在 1×10⁷ - 5×10⁷ 个 /mL 时，酵母细胞通透性可得到有效优化，为酵母细胞在基因工程、代谢工程等领域的应用提供了重要的技术支持，有助于进一步拓展酵母细胞在生物技术产业中的应用潜力。同时，本研究结果也为进一步深入研究酵母细胞电穿孔机制和开发新的细胞处理技术奠定了基础。