多聚赖氨酸硅纳米制备及其体外细胞转染实验

一、引言

基因治疗作为一种新兴的治疗策略，在治疗多种遗传性和获得性疾病方面展现出巨大的潜力。其中，安全高效的基因载体是基因治疗成功的关键因素之一。传统的病毒载体虽然转染效率高，但存在免疫原性、潜在的致瘤性等严重问题。非病毒载体，如脂质体和聚合物纳米粒，由于其低免疫原性和易于合成等优点受到广泛关注。

硅纳米材料因其良好的生物相容性、易于表面修饰等特点，在生物医学领域有着广泛的应用前景。多聚赖氨酸是一种具有良好生物相容性且带正电荷的聚合物，能够与带负电荷的核酸分子通过静电相互作用结合。将多聚赖氨酸与硅纳米材料结合，可以制备出一种新型的纳米载体，有望实现高效、低毒的基因转染。本研究聚焦于多聚赖氨酸硅纳米载体的制备及其体外细胞转染性能的研究，旨在为基因治疗载体的发展提供新的思路和方法。

二、材料与方法

（一）材料

化学试剂
正硅酸乙酯（TEOS）、3 - 氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、多聚赖氨酸（PLL，不同分子量）、荧光标记的质粒 DNA（如绿色荧光蛋白表达质粒，pEGFP - N1）、细胞培养基（如 DMEM 培养基）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶 - EDTA 溶液、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）等。

细胞系
选用常用的体外细胞模型，如 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞）或 293T 细胞（人胚肾细胞）。

（二）多聚赖氨酸硅纳米粒子的制备

硅纳米粒子的合成
采用经典的 Stöber 法合成硅纳米粒子。在乙醇 - 水混合溶液中，加入氨水作为催化剂，缓慢滴加 TEOS。反应方程式如下：

反应在室温下搅拌一定时间（如 2 - 4 小时），通过离心收集硅纳米粒子，并用乙醇多次洗涤以去除杂质。

硅纳米粒子的氨基化
将合成的硅纳米粒子分散于甲苯中，加入 APTES，在氮气保护下加热回流反应。APTES 的氨基与硅纳米粒子表面的羟基发生反应，使硅纳米粒子表面带有氨基。反应式为：

反应结束后，离心收集氨基化硅纳米粒子，并用甲苯和乙醇依次洗涤。

多聚赖氨酸的偶联
将氨基化硅纳米粒子分散于 PBS 中，加入不同浓度的多聚赖氨酸溶液，在室温下搅拌反应一定时间（如 12 - 24 小时）。多聚赖氨酸的氨基与氨基化硅纳米粒子表面的氨基通过交联剂（如戊二醛）进行共价偶联。反应式为：

反应完成后，通过离心收集多聚赖氨酸硅纳米粒子，并用 PBS 多次洗涤以去除未反应的多聚赖氨酸。

（三）多聚赖氨酸硅纳米粒子的表征

粒径与电位测定
采用动态光散射（DLS）技术测定多聚赖氨酸硅纳米粒子的粒径大小和表面电位。将纳米粒子分散于 PBS 中，在合适的测量角度和温度下进行测量。粒径的大小影响纳米粒子在细胞内的摄取和分布，表面电位则与纳米粒子与细胞的相互作用以及与核酸的结合能力密切相关。

形态观察
利用透射电子显微镜（TEM）观察多聚赖氨酸硅纳米粒子的形态。将纳米粒子分散于乙醇溶液中，滴加在铜网上，干燥后在 TEM 下观察。TEM 图像可以直观地显示纳米粒子的形状、大小和分散性。

红外光谱分析
采用傅里叶变换红外光谱（FT - IR）分析多聚赖氨酸硅纳米粒子的化学结构。通过比较纳米粒子在偶联前后的红外光谱图，可以确定多聚赖氨酸是否成功偶联到硅纳米粒子上。例如，多聚赖氨酸的特征吸收峰（如酰胺键的吸收峰）在偶联后的纳米粒子光谱中出现，可作为成功偶联的证据。

（四）体外细胞转染实验

细胞培养
将 HeLa 细胞或 293T 细胞接种于培养皿中，在含有 10% FBS 和 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养。当细胞生长至合适密度（如 70 - 80% 汇合度）时，用于转染实验。

转染实验分组
设置不同的转染组，包括空白对照组（只加细胞和培养基）、阳性对照组（使用已知的高效转染试剂，如 Lipofectamine 2000 转染质粒 DNA）、不同浓度的多聚赖氨酸硅纳米粒子转染组（如含有不同质量浓度的纳米粒子与固定量的质粒 DNA 混合）。

转染过程
将多聚赖氨酸硅纳米粒子与荧光标记的质粒 DNA 按照一定比例（如质量比为 1:1 - 10:1）在 PBS 中混合，室温下孵育一定时间（如 30 分钟），使纳米粒子与质粒 DNA 充分结合形成复合物。然后将复合物加入到细胞培养皿中，继续培养一定时间（如 4 - 6 小时）。之后，更换为新鲜的培养基，继续培养 24 - 48 小时。

转染效率检测
采用荧光显微镜观察细胞内的绿色荧光蛋白表达情况，计算转染效率。随机选取多个视野，统计荧光阳性细胞数占总细胞数的比例。同时，利用流式细胞术进一步定量分析转染效率，通过检测细胞的荧光强度来确定转染细胞的比例。

细胞毒性评价
采用 MTT 法评价多聚赖氨酸硅纳米粒子的细胞毒性。在转染后的不同时间点（如 24、48、72 小时），向细胞培养孔中加入 MTT 溶液，继续培养 4 小时。然后吸出培养基，加入 DMSO 溶解结晶物，在酶标仪上测定 570nm 处的吸光度值。细胞存活率计算公式为：细胞存活率处理组吸光度值对照组吸光度值

三、结果与讨论

（一）多聚赖氨酸硅纳米粒子的表征结果

粒径与电位
DLS 测量结果显示，制备的多聚赖氨酸硅纳米粒子粒径在合适的范围内（如 50 - 200nm）。随着多聚赖氨酸偶联量的增加，粒径略有增大，这可能是由于多聚赖氨酸分子的增加导致纳米粒子表面增厚。纳米粒子表面电位在偶联多聚赖氨酸后呈现正电性，且电位值随着多聚赖氨酸浓度的增加而增大，这有利于与带负电的质粒 DNA 结合。

形态观察
TEM 图像表明，多聚赖氨酸硅纳米粒子呈球形，分散性良好，没有明显的团聚现象。纳米粒子的粒径与 DLS 测量结果基本一致，进一步证实了制备方法的可靠性。

红外光谱分析
FT - IR 光谱显示，在偶联多聚赖氨酸后，纳米粒子在酰胺键特征吸收峰区域出现了新的吸收峰，这有力地证明了多聚赖氨酸成功地偶联到了硅纳米粒子上。

（二）体外细胞转染实验结果

转染效率
荧光显微镜观察和流式细胞术分析结果显示，多聚赖氨酸硅纳米粒子具有一定的转染效率。在一定的浓度范围内，随着纳米粒子浓度的增加，转染效率逐渐提高。与阳性对照组相比，虽然转染效率略低，但在较低的细胞毒性下仍能实现可观的基因转染。不同分子量的多聚赖氨酸对转染效率也有影响，合适分子量的多聚赖氨酸制备的纳米载体转染效率更高，这可能与多聚赖氨酸与质粒 DNA 的结合能力以及细胞摄取机制有关。

细胞毒性
MTT 实验结果表明，多聚赖氨酸硅纳米粒子在较低浓度下对细胞的毒性较小。随着纳米粒子浓度的增加和培养时间的延长，细胞存活率有所下降，但在合适的转染条件下，细胞仍能保持较高的存活率。这表明所制备的纳米载体具有较好的生物安全性，有利于其在基因治疗中的应用。

（三）讨论

本研究成功制备了多聚赖氨酸硅纳米粒子，并对其体外细胞转染性能进行了研究。结果表明，这种新型纳米载体在基因转染方面具有一定的优势。其良好的转染效率可能归因于多聚赖氨酸与质粒 DNA 的有效结合以及硅纳米粒子的合适粒径和表面性质，有利于细胞摄取。同时，相对较低的细胞毒性使其在生物医学应用中具有更大的潜力。然而，与传统的高效转染试剂相比，仍有进一步提高转染效率的空间。未来的研究可以从优化纳米粒子的制备工艺、进一步调控表面性质以及探索与其他功能分子的协同作用等方面入手，以进一步提高多聚赖氨酸硅纳米载体的转染性能。

四、结论

本研究通过一系列实验制备了多聚赖氨酸硅纳米粒子，并对其进行了全面的表征和体外细胞转染实验。结果显示，该纳米粒子具有合适的粒径、正电性表面和良好的生物相容性，在体外细胞转染中表现出一定的转染效率和较低的细胞毒性。尽管仍有改进的空间，但本研究为开发新型、高效、安全的基因载体提供了有价值的参考，有望为基因治疗领域带来新的突破。