荧光原位杂交技术诊断羊水细胞染色体异常

一、引言

染色体异常是导致胎儿先天畸形、智力低下、发育迟缓等多种不良妊娠结局的重要原因之一。产前诊断对于发现染色体异常胎儿，为家庭和临床提供决策依据具有至关重要的作用。传统的染色体核型分析是产前诊断的金标准，但该方法存在操作复杂、耗时长（一般需要数天至数周）等缺点，尤其是对于急需诊断结果的孕妇（如孕周较大等情况）并不十分理想。

荧光原位杂交（FISH）技术作为一种分子细胞遗传学技术，具有快速、灵敏、特异性高的特点，能够在较短时间内对羊水细胞中的特定染色体异常进行检测。它可以检测染色体的数目异常，如 21 - 三体、18 - 三体、13 - 三体等，以及部分染色体结构异常。近年来，FISH 技术在产前诊断领域得到了广泛应用，为染色体异常的早期诊断提供了一种有效的手段，大大提高了产前诊断的效率和质量。

二、荧光原位杂交技术原理

FISH 技术是基于核酸分子杂交原理。它利用已知序列的荧光标记核酸探针与细胞内的染色体 DNA 进行特异性杂交。这些探针可以特异性地识别染色体上特定的基因序列或区域。当探针与目标 DNA 序列互补结合后，在荧光显微镜下可以观察到荧光信号。通过对荧光信号的数量、位置和分布等特征的分析，可以判断染色体的数目和结构是否正常。

例如，对于检测 21 - 三体综合征，可以使用针对 21 号染色体特异性的探针。正常细胞中，在荧光显微镜下会观察到两个特定的荧光信号（对应两条 21 号染色体），而如果是 21 - 三体细胞，则会观察到三个荧光信号。

三、实验材料与方法

（一）羊水样本采集

羊水样本一般在孕中期（16 - 22 周）通过羊膜腔穿刺术获取。在超声引导下，将穿刺针经腹壁、子宫壁刺入羊膜腔，抽取一定量（一般 10 - 20ml）的羊水。采集过程中要严格遵循无菌操作原则，以防止感染。采集后的羊水应立即送检，避免长时间放置导致细胞活性降低。

（二）羊水细胞处理

1. 离心分离
将采集到的羊水样本在低温离心机中以适当的转速（如 1000 - 1500rpm）离心 10 - 15 分钟，使羊水细胞沉淀在离心管底部。

2. 细胞培养（可选）
对于需要进一步培养以获得更多细胞的情况，可以将沉淀的羊水细胞接种到特定的培养基中，在合适的培养条件（37℃、5% CO₂）下培养数天。培养后的细胞可以获得更好的细胞形态和更多的染色体信息，但这会增加诊断时间。在一些紧急情况下，可以直接使用未经培养的羊水细胞进行 FISH 检测。

3. 细胞固定
无论是培养后的细胞还是直接离心获得的细胞，都需要进行固定处理。常用的固定剂为甲醇 - 冰醋酸（3:1）混合液。将细胞悬浮在固定剂中，反复固定几次，以保证细胞结构完整，染色体形态清晰，便于后续杂交操作。

（三）探针选择与标记

1. 探针类型
根据需要检测的染色体异常类型选择合适的探针。常见的探针包括染色体着丝粒探针、染色体特异性位点探针和全染色体涂抹探针等。例如，对于常见的三体综合征诊断，常使用着丝粒探针。对于检测染色体易位等结构异常，可以使用特异性位点探针或全染色体涂抹探针。

2. 探针标记
探针标记有直接标记和间接标记两种方式。直接标记是将荧光素（如 FITC、Cy3、Cy5 等）直接连接到探针上。间接标记则是先将生物素等标记物连接到探针上，然后在杂交后通过与荧光标记的亲和物质（如荧光标记的抗生物素抗体或抗抗体）反应来显示荧光信号。直接标记操作相对简单，而间接标记可以通过信号放大提高检测灵敏度。

（四）杂交过程

1. 预处理
将固定好的羊水细胞涂片或滴片在适当的预处理液（如 70% 甲酰胺 / 2×SSC）中处理，使染色体 DNA 变性，成为单链状态，便于与探针杂交。处理温度和时间需要严格控制，一般在 70 - 75℃处理数分钟。

2. 杂交反应
将标记好的探针与预处理后的羊水细胞样本混合，滴加到载玻片上，盖上盖玻片，在合适的杂交温度（一般 37℃）下进行杂交反应。杂交反应时间根据探针类型和长度不同而有所差异，一般需要数小时至过夜。在杂交过程中，探针与染色体上的目标 DNA 序列特异性结合。

（五）检测与结果分析

1. 洗涤
杂交完成后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针。洗涤液一般采用不同浓度的 SSC 溶液和吐温 - 20。通过逐步降低盐浓度和温和的洗涤剂作用，将非特异性结合的探针洗脱，而保留特异性结合的探针。

2. 荧光显微镜观察
将洗涤后的载玻片在荧光显微镜下观察。使用合适的滤光片来激发和检测不同荧光标记的信号。观察细胞内荧光信号的数量、位置和形态。对于染色体数目异常的诊断，根据特定染色体探针的荧光信号数量进行判断。例如，正常细胞中针对某条染色体的两个荧光信号，若出现三个或更多，则提示该染色体数目异常。对于结构异常，观察荧光信号的分布和形态变化，如染色体易位可能导致两个不同染色体的荧光信号在空间上出现异常的连接或融合。

3. 结果判断标准
建立严格的结果判断标准非常重要。对于荧光信号的强度、清晰度和特异性都要有明确的界定。一般要求荧光信号明亮、清晰，与背景有明显区别。同时，要对多个细胞进行观察和分析，以减少假阳性和假阴性结果。对于一些临界结果，可能需要重复实验或结合其他诊断方法进一步确认。

四、FISH 技术在诊断染色体异常中的应用

（一）常见染色体数目异常诊断

21 - 三体综合征（唐氏综合征）
使用 21 号染色体着丝粒探针进行 FISH 检测，可以快速准确地检测羊水细胞中的 21 - 三体情况。与传统核型分析相比，FISH 技术可以在 24 - 48 小时内得出结果，大大缩短了诊断时间。在临床实践中，对于高龄孕妇或唐筛高风险孕妇的羊水样本，FISH 检测为及时发现 21 - 三体胎儿提供了有力支持。

18 - 三体综合征（爱德华兹综合征）和 13 - 三体综合征（帕陶综合征）
类似地，针对 18 号和 13 号染色体的着丝粒探针也可用于检测相应的三体综合征。这些染色体异常往往伴随着严重的胎儿畸形和发育障碍，早期诊断可以为家庭和医生提供决策依据，如是否选择终止妊娠等。

（二）染色体结构异常诊断

1. 染色体易位
对于一些携带染色体平衡易位的夫妇，其胎儿有一定的染色体异常风险。通过使用特异性位点探针或全染色体涂抹探针，可以检测羊水细胞中是否存在染色体易位情况。例如，在检测罗伯逊易位时，FISH 技术可以清晰地显示两条近端着丝粒染色体之间的融合情况，帮助判断胎儿是否遗传了易位染色体，以及是否存在不平衡易位导致的基因缺失或重复。

2. 染色体缺失和重复
某些染色体微缺失和微重复综合征（如 DiGeorge 综合征、Prader - Willi 综合征等）与特定染色体区域的基因缺失或重复有关。通过选择覆盖这些关键区域的探针，FISH 技术可以检测羊水细胞中是否存在相应的染色体异常。这种检测对于那些有家族遗传病史或超声检查发现胎儿结构异常的情况尤为重要。

五、FISH 技术与传统染色体核型分析的比较

（一）优势

1. 快速诊断
FISH 技术可以在短时间内（一般 1 - 2 天）得出结果，而传统核型分析需要较长时间（一般 7 - 14 天）。这对于孕周较大、需要尽快得到诊断结果的孕妇非常有利，可以及时采取相应的措施。

2. 特异性高
由于使用的是特异性探针，FISH 技术对于特定染色体异常的检测具有很高的特异性。尤其是对于常见的三体综合征等，其诊断准确性与传统核型分析相当。

3. 可检测染色体微小异常
对于一些染色体微缺失和微重复等微小结构异常，FISH 技术在选择合适探针的情况下能够进行检测，而传统核型分析可能由于分辨率的限制而难以发现。

（二）局限性

1. 检测范围有限
FISH 技术只能检测已知序列的特定染色体异常，需要根据预先设计的探针来进行检测。如果存在未知的染色体异常或探针未覆盖的区域异常，则可能会漏诊。而传统核型分析可以对整个染色体组进行全面观察。

2. 结果解读相对复杂
FISH 技术的结果解读需要对荧光信号有准确的判断，对于一些信号不清晰或复杂的情况（如嵌合体等），解读难度较大。而且不同实验室之间可能存在一定的结果判断差异，需要建立标准化的操作和解读流程。

六、临床案例分析

（一）病例资料

某孕妇，38 岁，孕 20 周，唐筛结果显示 21 - 三体高风险。超声检查发现胎儿颈部透明层增厚。经羊膜腔穿刺获取羊水样本进行 FISH 检测和传统核型分析。

（二）检测过程与结果

1. FISH 检测
使用 21 号染色体着丝粒探针进行 FISH 检测，在羊水细胞中观察到三个明亮的荧光信号，提示 21 - 三体可能。整个 FISH 检测过程在 24 小时内完成。

2. 传统核型分析
同时进行的传统核型分析在 10 天后得出结果，确诊为 21 - 三体综合征。

（三）讨论

在这个案例中，FISH 技术快速地为临床提供了初步诊断结果，为后续的咨询和决策提供了及时的信息。虽然传统核型分析是确诊的金标准，但 FISH 技术的快速诊断优势在这种情况下显得尤为重要，可以避免孕妇长时间的焦虑等待。同时，两者结果的一致性也证明了 FISH 技术在 21 - 三体诊断中的可靠性。

七、结论

荧光原位杂交技术在羊水细胞染色体异常诊断中具有重要的应用价值。它以其快速、灵敏、特异性高的特点，为产前诊断染色体异常尤其是常见的三体综合征和部分结构异常提供了一种有效的检测手段。虽然该技术存在一定的局限性，但与传统染色体核型分析相结合，可以大大提高产前诊断的准确性和效率。在临床实践中，应根据孕妇的具体情况（如孕周、唐筛结果、超声检查结果等）合理选择诊断方法，充分发挥 FISH 技术的优势，为降低染色体异常患儿的出生率、提高人口素质做出贡献。随着 FISH 技术的不断发展，如新型探针的开发、检测流程的优化等，其在产前诊断领域的应用前景将更加广阔。同时，也需要进一步加强实验室质量控制和人员培训，以确保检测结果的准确性和可靠性。