基因治疗作为一种新兴的治疗手段，在治疗多种遗传性和获得性疾病方面展现出巨大的潜力。然而，基因传递过程中的关键问题之一是寻找安全、高效的载体系统。病毒载体虽然转染效率高，但存在免疫原性和潜在的致瘤性等问题。因此，非病毒载体如纳米材料受到了广泛关注。
硅纳米粒（SiNPs）由于其良好的稳定性、易于表面修饰和可调节的物理化学性质等优点，在生物医学领域展现出良好的应用前景。多聚赖氨酸（PLL）是一种阳离子聚合物，具有良好的生物相容性和与核酸的结合能力。将 PLL 修饰到 SiNPs 表面有望提高纳米粒与核酸的相互作用，并促进细胞摄取和转染。本研究旨在制备多聚赖氨酸硅纳米粒，并深入研究其在细胞转染中的性能。
正硅酸四乙酯（TEOS）、氨水、多聚赖氨酸（PLL，不同分子量）、3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基)-2,5 - 二苯基四氮唑溴盐（MTT）、荧光标记的 DNA（F - DNA）、细胞培养基（DMEM、RPMI 1640 等）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、不同细胞系（如 HeLa、293T、MCF - 7 等）。
硅纳米粒的合成
采用经典的 Stöber 法合成硅纳米粒。在乙醇 - 水混合溶液中，将正硅酸四乙酯（TEOS）在氨水的催化作用下发生水解和缩聚反应。具体步骤如下：将一定量的乙醇、水和氨水混合均匀，然后逐滴加入 TEOS。反应在室温下持续搅拌数小时后，通过离心收集纳米粒，并用乙醇多次洗涤以去除杂质，得到纯净的硅纳米粒。
多聚赖氨酸修饰硅纳米粒
将合成的硅纳米粒分散在适当的缓冲溶液（如磷酸盐缓冲液，PBS）中。然后，将不同浓度的多聚赖氨酸溶液逐滴加入到纳米粒分散液中，在温和搅拌下反应一定时间。反应结束后，通过离心洗涤去除未结合的多聚赖氨酸，得到多聚赖氨酸硅纳米粒（PLL - SiNPs）。通过改变 PLL 的浓度和反应时间等条件，优化修饰过程，以获得最佳性能的纳米粒。
粒径和电位测定
使用动态光散射（DLS）仪器测定纳米粒的粒径大小和表面电位。将制备好的 PLL - SiNPs 分散在 PBS 中，测量其粒径分布和平均粒径，同时测量纳米粒表面的 zeta 电位，以评估纳米粒的稳定性和表面电荷性质。
形态观察
通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形态。将纳米粒分散液滴在铜网上，晾干后在 TEM 下观察其形状、大小和分散情况。
细胞培养
将不同的细胞系（如 HeLa、293T、MCF - 7 等）培养在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的相应培养基中，在 37°C、5% CO₂的培养箱中培养。当细胞生长至合适密度时，进行后续实验。
纳米粒标记与摄取检测
将 PLL - SiNPs 与荧光标记的 DNA（F - DNA）混合，孵育一段时间后，加入到培养的细胞中。在不同时间点（如 1、2、4、6 小时等），用 PBS 洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化收集细胞。通过流式细胞术（FCM）检测细胞内的荧光强度，以评估纳米粒的细胞摄取情况。同时，利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察纳米粒在细胞内的分布情况。
转染效率测定
将含有报告基因（如绿色荧光蛋白基因，GFP）的质粒 DNA 与 PLL - SiNPs 混合，形成纳米粒 - DNA 复合物。将复合物加入到培养的细胞中，培养一定时间（24 - 48 小时）后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，计算转染效率。同时，采用流式细胞术进一步定量分析转染效率。
转染条件优化
通过改变纳米粒与 DNA 的比例、转染时间、转染温度等条件，优化转染过程，以获得最高的转染效率。
MTT 法检测细胞活力
将不同浓度的 PLL - SiNPs 加入到培养的细胞中，培养 24、48 和 72 小时后，加入 MTT 溶液。继续培养 4 小时后，弃去培养液，加入 DMSO 溶解结晶物。在酶标仪上测定 570nm 处的吸光度值，计算细胞活力，评估纳米粒的细胞毒性。
粒径和电位
动态光散射结果显示，合成的硅纳米粒粒径在一定范围内（例如 100 - 200nm），表面电位为负。经过多聚赖氨酸修饰后，PLL - SiNPs 的粒径略有增加，这可能是由于 PLL 的附着。同时，表面电位变为正，这有利于与带负电的 DNA 相互作用。
形态观察
透射电子显微镜图像表明，硅纳米粒呈球形，粒径均匀，分散良好。多聚赖氨酸修饰后，纳米粒的形态基本保持不变。
流式细胞术结果显示，随着时间的增加，细胞对 PLL - SiNPs - F - DNA 复合物的摄取量逐渐增加。共聚焦激光扫描显微镜图像清晰地显示了纳米粒在细胞内的分布，主要分布在细胞质中，部分纳米粒可进入细胞核周围区域。不同细胞系对纳米粒的摄取效率有所差异，这可能与细胞类型相关的膜受体和内吞机制有关。
转染效率
荧光显微镜观察和流式细胞术定量分析表明，PLL - SiNPs 在多种细胞系中均能实现基因转染。在优化条件下，转染效率可达到较高水平，例如在 HeLa 细胞中，转染效率可达到 [X]%，与一些传统的非病毒载体相比具有一定优势。
转染条件优化
研究发现，纳米粒与 DNA 的比例对转染效率有显著影响。当比例为 [最佳比例] 时，转染效率高。此外，转染时间和温度也对转染效果有一定影响，适当延长转染时间和在 37°C 下转染有利于提高转染效率。
MTT 法检测结果表明，在一定浓度范围内（如低于 [具体浓度]），PLL - SiNPs 对细胞活力没有明显影响，表明纳米粒具有良好的生物相容性。然而，当纳米粒浓度过高时，细胞活力会有所下降，提示在实际应用中需要注意纳米粒的使用剂量。
本研究成功制备了多聚赖氨酸硅纳米粒，并对其细胞摄取、转染效率和生物相容性进行了详细研究。多聚赖氨酸的修饰不仅改变了硅纳米粒的表面电荷，有利于与 DNA 的结合，还促进了细胞对纳米粒的摄取。细胞转染实验结果表明，PLL - SiNPs 作为一种非病毒载体具有较高的转染效率，其性能可通过优化纳米粒与 DNA 的比例、转染时间和温度等条件进一步提高。
生物相容性评价结果显示，在合适的浓度范围内，纳米粒对细胞活力影响较小，这为其在生物医学领域的应用提供了有利条件。然而，仍需要进一步深入研究纳米粒在体内的分布、代谢和长期安全性等问题。此外，与其他先进的载体系统相比，PLL - SiNPs 的转染效率还有进一步提升的空间，可以考虑结合其他功能分子或采用新型的制备策略来改进。
本研究制备的多聚赖氨酸硅纳米粒具有良好的理化性质、较高的细胞摄取和转染效率以及可接受的生物相容性。这些结果为其在基因治疗和其他生物医学领域的应用提供了有价值的数据支持。未来的研究将聚焦于进一步优化纳米粒的性能和深入评估其体内安全性，以推动其向临床应用的转化。
