烟草（Nicotiana tabacum）作为一种重要的经济作物和模式植物，在农业生产和植物科学研究中具有广泛的应用。基因工程技术为烟草的遗传改良提供了强大的手段，其中花粉介导的遗传转化具有更好的优势，如能够避免体细胞变异、可直接获得转基因配子等。脱外壁花粉由于去除了外壁的物理屏障，理论上更有利于外源基因的导入。基因枪法作为一种常用的遗传转化方法，已在多种植物材料的转化中取得成功。然而，关于基因枪法介导 GUS 基因转入烟草脱外壁花粉的研究报道相对较少。因此，本研究开展相关实验，旨在深入了解这一转化过程的特性和规律，为烟草遗传转化技术的拓展提供有价值的信息。
选用烟草（Nicotiana tabacum L.）品种‘K326’作为实验材料。在温室中培养烟草植株，保持适宜的温度（25 ± 2°C）、湿度（60% - 70%）和光照周期（16 h 光照 / 8 h 黑暗）。
采集处于单核靠边期的烟草花蕾，用 70% 乙醇表面消毒 30 s，再用 0.1% HgCl₂消毒 8 - 10 min，然后用无菌水冲洗 3 - 4 次。
将消毒后的花蕾在无菌条件下取出花药，置于含有 10% 蔗糖、0.01% 硼酸、0.5% 纤维素酶和 0.2% 果胶酶的酶解液中，在 28°C、黑暗条件下酶解 2 - 3 h。
酶解结束后，通过 40 μm 滤网过滤除去杂质，收集花粉，用 15% 蔗糖溶液离心洗涤 2 - 3 次，得到脱外壁花粉，将其悬浮于适量的转化缓冲液中备用。
质粒构建
构建含有 GUS 基因的植物表达质粒，该质粒以 CaMV 35S 为启动子驱动 GUS 基因的表达，并含有筛选标记基因（如潮霉素抗性基因）。
金粉准备
称取 60 mg 直径为 1.0 μm 的金粉，悬浮于 1 mL 无水乙醇中，振荡混匀后离心收集金粉，用无菌水洗涤 2 - 3 次，最后将金粉重新悬浮于 1 mL 无菌水中，备用。
微弹制备
取 50 μL 金粉悬浮液，依次加入 10 μL 质粒 DNA（浓度为 1 μg/μL）、50 μL 2.5 M CaCl₂和 20 μL 0.1 M 亚精胺，振荡混匀后静置 10 min，离心收集沉淀，用 70% 乙醇和无水乙醇各洗涤一次，最后将沉淀重新悬浮于 60 μL 无水乙醇中。
基因枪射击
将适量的脱外壁花粉均匀涂布于培养皿中的固体培养基表面，待花粉稍干燥后，将制备好的微弹用基因枪（Bio - Rad PDS - 1000/He）按照设定的参数（如氦气压力 1100 psi、真空度 28 inHg、射击距离 6 cm 等）进行射击。
组织化学染色
在基因枪转化后 24 - 48 h，取部分转化后的花粉，加入 GUS 染色液（含有 1 mM X - Gluc、50 mM 磷酸钠缓冲液 pH 7.0、0.5 mM 、0.5 mM 、0.1% Triton X - 100），在 37°C 黑暗条件下染色 2 - 4 h。染色结束后，用 70% 乙醇脱色，在显微镜下观察并统计蓝色染色的花粉数量，以计算 GUS 基因的瞬时表达率。
荧光定量分析
提取转化后花粉的总 RNA，反转录合成 cDNA。以烟草 Actin 基因作为内参基因，设计 GUS 基因和 Actin 基因的特异性引物，采用实时荧光定量 PCR 技术检测 GUS 基因的相对表达量。反应体系按照 SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒说明书进行配制，在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应，反应条件为：95°C 预变性 3 min；95°C 变性 10 s，60°C 退火 30 s，72°C 延伸 30 s，共 40 个循环。根据扩增曲线和熔解曲线分析数据，计算 GUS 基因相对表达量。
为了提高基因枪介导的 GUS 基因转化效率，进行了一系列转化条件的优化实验，包括金粉用量、质粒 DNA 浓度、氦气压力、真空度和射击距离等因素。每个因素设置 3 - 5 个水平，采用正交实验设计，以 GUS 基因瞬时表达率为指标，筛选出最佳的转化条件组合。
经过酶解处理后获得的烟草脱外壁花粉在显微镜下观察呈现出球形，表面光滑，与完整外壁花粉具有明显的形态差异。脱外壁花粉的直径略有减小，且细胞质更加明显，这表明外壁已被有效去除，为外源基因的导入提供了有利条件。
组织化学染色结果
通过 GUS 组织化学染色，在基因枪转化后的花粉中观察到部分花粉呈现蓝色，表明 GUS 基因在这些花粉中得到了表达。未转化的对照花粉则无蓝色出现。统计不同处理组中蓝色花粉的数量，计算得到 GUS 基因的瞬时表达率在不同条件下有所差异，范围为 5% - 25%。
荧光定量分析结果
荧光定量 PCR 结果显示，转化后的花粉中 GUS 基因的相对表达量明显高于未转化的对照花粉。不同转化条件下 GUS 基因的相对表达量变化趋势与组织化学染色得到的瞬时表达率基本一致，进一步证实了 GUS 基因在烟草脱外壁花粉中的成功导入和表达。
经过正交实验设计和数据分析，得到最佳的基因枪转化条件组合为：金粉用量 30 μL、质粒 DNA 浓度 0.8 μg/μL、氦气压力 1300 psi、真空度 26 inHg、射击距离 5 cm。在该条件下，GUS 基因的瞬时表达率可达到 30% 以上，较优化前有显著提高。分析各因素对转化效率的影响发现，氦气压力和金粉用量对 GUS 基因瞬时表达率的影响较为显著，而质粒 DNA 浓度、真空度和射击距离的影响相对较小。
烟草脱外壁花粉去除了外壁的阻碍，使得外源基因更容易进入花粉细胞内部。与完整外壁花粉相比，其在基因转化过程中可能具有更高的转化效率。此外，脱外壁花粉的制备过程相对简单，且能够保持花粉的活力和受精能力，为后续的转基因操作提供了便利。
基因枪法作为一种物理转化方法，具有操作简便、不受宿主限制等优点。在本研究中，通过优化基因枪转化的各项参数，成功地将 GUS 基因导入烟草脱外壁花粉并实现了瞬时表达。然而，基因枪法也存在一些不足之处，如设备昂贵、转化效率相对较低等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况综合考虑其他转化方法，以提高烟草花粉介导的遗传转化效率。
GUS 基因是一种常用的报告基因，在本研究中用于检测外源基因在烟草脱外壁花粉中的表达情况。通过组织化学染色和荧光定量分析两种方法，能够直观、准确地反映 GUS 基因的瞬时表达水平。这为后续研究其他功能基因在烟草花粉中的表达调控提供了可靠的检测手段。
本研究建立的基因枪法介导 GUS 基因转入烟草脱外壁花粉的转化体系，为烟草的遗传改良提供了新的技术途径。通过将有益的外源基因导入烟草花粉，可以获得转基因烟草植株，有望在烟草的抗病性、品质改良等方面取得突破。此外，该技术也可为其他植物花粉介导的遗传转化研究提供参考和借鉴，促进植物基因工程技术的广泛应用。
本研究成功地建立了基因枪法介导 GUS 基因转入烟草脱外壁花粉的瞬时表达体系。通过对脱外壁花粉的制备、基因枪转化过程的优化以及 GUS 基因瞬时表达的检测与分析，确定了最佳的转化条件组合，提高了 GUS 基因的瞬时表达效率。本研究结果为烟草花粉介导的遗传转化研究提供了重要的理论依据和技术支持，有助于推动烟草基因工程育种的发展，同时也为其他植物相关研究提供了有益的参考。未来的研究可以进一步探索该转化体系在烟草功能基因组学研究和遗传改良实践中的应用，以及如何进一步提高转化效率和稳定性，以实现烟草产业的可持续发展。
