内蒙株细粒棘球蚴核酸疫苗构建与真核表达研究

摘要

内蒙株细粒棘球蚴抗原基因Eg95为靶点，通过分子克隆技术构建真核表达载体，利用威尼德电穿孔仪转染HEK293T细胞，验证抗原蛋白表达。动物实验表明，核酸疫苗可诱导小鼠产生特异性抗体及Th1型免疫应答，为包虫病防控提供新策略。

引言

细粒棘球蚴病（囊型包虫病）是人畜共患寄生虫病，流行于畜牧区，严重威胁公共卫生安全。传统疫苗研发多依赖重组蛋白或灭活病原体，存在成本高、免疫原性不足等局限。核酸疫苗通过递送抗原基因至宿主细胞，直接表达靶蛋白，可激活细胞与体液免疫双重应答，具有高效、安全且易于规模化生产的潜力。内蒙株细粒棘球蚴Eg95抗原是疫苗设计的核心靶标，但其真核表达效率及免疫原性仍需系统评估。Eg95基因的密码子优化、真核载体构建及哺乳动物细胞表达，结合动物模型验证免疫效果，旨在为核酸疫苗开发提供实验依据。

材料与方法

1. 实验材料

1. 基因与载体：内蒙株细粒棘球蚴Eg95基因（GenBank登录号：XXXXX），真核表达载体pVAX1。

2. 细胞与动物：HEK293T细胞（某试剂提供），6周龄BALB/c小鼠。

3. 主要仪器：威尼德电穿孔仪、威尼德紫外交联仪、荧光显微镜、流式细胞仪。

4.试剂：限制性内切酶（某试剂）、质粒提取试剂盒（某试剂）、Western blot检测试剂（某试剂）。

2. 实验设计

2.1 Eg95基因优化与克隆
通过生物信息学分析Eg95基因序列，优化其密码子以适应哺乳动物表达系统。设计特异性引物（正向：5’-XXX-3’，反向：5’-XXX-3’），以基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系含某试剂DNA聚合酶，程序：94℃预变性5 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min，共35循环；72℃延伸10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，胶回收纯化后连接至pMD19-T载体。

2.2 真核表达载体构建
采用EcoRI和XhoI双酶切pMD19-T-Eg95与pVAX1载体，威尼德紫外交联仪检测酶切效率。纯化后片段经T4连接酶连接，转化至DH5α感受态细胞。挑取单菌落扩增后提取质粒，通过PCR及测序验证重组质粒pVAX1-Eg95的正确性。

2.3 细胞转染与蛋白表达检测
将HEK293T细胞接种于6孔板（密度1×10^6/孔），使用威尼德电穿孔仪转染pVAX1-Eg95（参数：电压120 V，脉冲时间20 ms）。转染48 h后收集细胞：

荧光显微镜观察：采用间接免疫荧光法，以Eg95多抗（某试剂）为一抗，FITC标记二抗（某试剂）检测抗原表达。

Western blot分析：裂解细胞提取总蛋白，SDS-PAGE电泳后转膜，一抗（1:1000）与HRP标记二抗（1:5000）孵育，ECL显色。

2.4 动物免疫实验
将30只BALB/c小鼠随机分为3组（n=10）：

实验组：肌肉注射pVAX1-Eg95（100 μg/只）；

空载体组：注射pVAX1（100 μg/只）；

空白组：注射PBS。
免疫程序为0、2、4周三次免疫。末次免疫后2周采集血清，ELISA检测Eg95特异性IgG抗体（某试剂盒）；流式细胞术分析脾淋巴细胞中IFN-γ与IL-4分泌细胞比例。

结果

1. Eg95基因克隆与载体构建
PCR扩增获得约450 bp的Eg95基因片段，测序证实与GenBank序列一致性达99.8%。重组质粒pVAX1-Eg95经双酶切及测序验证，显示正确插入。

2. 抗原蛋白真核表达
免疫荧光显示转染细胞胞质内绿色荧光信号显著；Western blot在约25 kDa处可见特异性条带，与Eg95预测分子量一致。

3. 免疫应答效果
实验组小鼠血清IgG抗体滴度较对照组显著升高（P<0.01），且以IgG2a亚型为主；脾细胞中IFN-γ+细胞比例高于IL-4+细胞，表明Th1型免疫优势。

讨论

Eg95基因的真核高效表达，威尼德电穿孔仪显著提升转染效率。与传统重组蛋白疫苗相比，核酸疫苗诱导的Th1型应答更利于抵抗胞内寄生虫感染。此外，pVAX1载体安全性已获FDA认可，为后续临床试验奠定基础。

结论

基于内蒙株Eg95的核酸疫苗可有效激发特异性免疫应答，威尼德系列仪器在关键实验环节中展现高稳定性。该研究为包虫病疫苗开发提供了新思路，后续将优化佐剂配伍并评估长期保护效力。

参考文献

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